色谱、质谱和光谱分析简介

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第一节 色谱、质谱和光谱分析简介        1
第二节 色谱分析        14
第三节 质谱分析        59
第四节 有机质谱及相关知识        92

序言

本书介绍了色谱分析、质谱分析、光谱分析的基础知识，并且简要介绍了色谱分析的方法及实例。对于质谱分析，不仅大致介绍了质谱分析的相关内容，还针对有机质谱及相关知识进行了简要的介绍，希望本书能给在分析岗位的川友带来一些帮助。
第一节 色谱、质谱和光谱分析简介
一、3种分析方法简介
1、色谱分析
    基于混合物各组分在体系中两相的物理化学性能差异（如吸附、分配差异等）而进行分离和分析的方法。国际公认俄国M.C.茨维特为色谱法的创始人。
色谱法体系中的两相作相对运动时，通常其中一个相是固定不动的 ，称为固定相；另一相是移动的，称为流动相。在色谱分析过程中，物质的迁移速度取决于它们与固定相和流动相的相对作用力。溶质和两相的吸引力是分子间的作用力，包括色散力、诱导效应、场间效应、氢键力和路易斯酸碱相互作用。对于离子，还有离子间的静电吸引力。被较强吸引在固定相上的溶质相对滞后于较强地吸引在流动相中的溶质，随着移动的反复进行与多次分配，使混合物中的各组分得到分离。
色谱分析法的分类比较复杂。根据流动相和固定相的不同，色谱法分为气相色谱法和液相色谱法。①气相色谱法的流动相是气体，又可分为：气固色谱法，其流动相是气体，固定相为固体；气液色谱法，其流动相是气体，固定相是涂在惰性固体上的液体。②液相色谱法的流动相是液体，又可分为液固色谱法，其流动相是液体，固定相是固体；②液液色谱法，其流动相和固定相均是液体。按吸附剂及其使用形式可分为柱色谱、纸色谱和薄层色谱。按吸附力可分为吸附色谱、离子交换色谱、分配色谱和凝胶渗透色谱。按色谱操作终止的方法可分为展开色谱和洗脱色谱。按进样方法可分为区带色谱、迎头色谱和顶替色谱。
经色谱分离出的各组分，与已知标准样品对照进行定性分析。现代化的色谱-质谱联用或色谱-光谱联用仪器，配备有丰富的谱图库和微处理机。色谱柱流出的组分直接送入质谱和光谱仪进行定性鉴定和数据的定量处理。开发智能化色谱分析是发展的主要方向。
色谱法的特点是：①分离效率高。可分离性质十分相近的物质，可将含有上百种组分的复杂混合物进行分离。②分离速度快。几分钟到几十分钟就能完成一次复杂物质的分离操作。③灵敏度高。能检测含量在10-12克以下的物质。④可进行大规模的纯物质制备。
色谱法在化工、石油、生物化学、医药卫生、环境保护、食品检验、法医检验、农业等各个领域都有广泛的应用。在各种色谱法中，以气液色谱法和液固色谱法应用最广。气相色谱法分离中、小分子化合物比较理想。中等大小的分子可用液液色谱和液固色谱分离。离子交换色谱一般用于有离子基团的物质。分子尺寸再大时，用凝胶渗透色谱分离。薄层色谱和纸色谱法的分析速度快、方便、成本低，柱色谱比薄层色谱和纸色谱具有更高的分辨能力。
2、质谱分析
质谱法(Mass Spectrometry,MS)即用电场和磁场将运动的离子（带电荷的原子、分子或分子碎片，有分子离子、同位素离子、碎片离子、重排离子、多电荷离子、亚稳离子、负离子和离子－分子相互作用产生的离子）按它们的质荷比分离后进行检测的方法。测出离子准确质量即可确定离子的化合物组成。这是由于核素的准确质量是一多位小数，决不会有两个核素的质量是一样的，而且决不会有一种核素的质量恰好是另一核素质量的整数倍。分析这些离子可获得化合物的分子量、化学结构、裂解规律和由单分子分解形成的某些离子间存在的某种相互关系等信息。
1898年W.维恩用电场和磁场使正离子束发生偏转时发现,电荷相同时，质量小的离子偏转得多,质量大的离子偏转得少。1913年J.J.汤姆孙和F.W.阿斯顿用磁偏转仪证实氖有两种同位素[kg1]Ne和[kg1]Ne阿斯顿于1919年制成一台能分辨一百分之一质量单位的质谱计，用来测定同位素的相对丰度，鉴定了许多同位素。但到1940年以前质谱计还只用于气体分析和测定化学元素的稳定同位素。后来质谱法用来对石油馏分中的复杂烃类混合物进行分析，并证实了复杂分子能产生确定的能够重复的质谱之后,才将质谱法用于测定有机化合物的结构,开拓了有机质谱的新领域。
使试样中各组分电离生成不同荷质比的离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器，利用电场和磁场使发生相反的速度色散——离子束中速度较慢的离子通过电场后偏转大，速度快的偏转小；在磁场中离子发生角速度矢量相反的偏转，即速度慢的离子依然偏转大，速度快的偏转小；当两个场的偏转作用彼此补偿时，它们的轨道便相交于一点。与此同时，在磁场中还能发生质量的分离，这样就使具有同一质荷比而速度不同的离子聚焦在同一点上，不同质荷比的离子聚焦在不同的点上，将它们分别聚焦而得到质谱图，从而确定其质量。
质谱法还可以进行有效的定性分析，但对复杂有机化合物分析就无能为力了，而且在进行有机物定量分析时要经过一系列分离纯化操作，十分麻烦。而色谱法对有机化合物是一种有效的分离和分析方法，特别适合进行有机化合物的定量分析，但定性分析则比较困难，因此两者的有效结合将提供一个进行复杂化合物高效的定性定量分析的工具。
质谱法特别是它与色谱仪及计算机联用的方法，已广泛应用在有机化学、生化、药物代谢、临床、毒物学、农药测定、环境保护、石油化学、地球化学、食品化学、植物化学、宇宙化学和国防化学等领域。用质谱计作多离子检测，可用于定性分析，例如，在药理生物学研究中能以药物及其代谢产物在气相色谱图上的保留时间和相应质量碎片图为基础，确定药物和代谢产物的存在；也可用于定量分析，用被检化合物的稳定性同位素异构物作为内标，以取得更准确的结果。
在无机化学和核化学方面，许多挥发性低的物质可采用高频火花源由质谱法测定。该电离方式需要一根纯样品电极。如果待测样品呈粉末状，可和镍粉混合压成电极。此法对合金、矿物、原子能和半导体等工艺中高纯物质的分析尤其有价值，有可能检测出含量为亿分之一的杂质。
利用存在寿命较长的放射性同位素的衰变来确定物体存在的时间,在考古学和地理学上极有意义。例如,某种放射性矿物中有放射性铀及其衰变产物铅的存在，铀238和铀235的衰变速率是已知的，则由质谱测出铀和由于衰变产生的铅的同位素相对丰度，就可估计该轴矿物生成的年代。
质谱仪种类繁多，不同仪器应用特点也不同,一般来说，在300C左右能汽化的样品，可以优先考虑用GC-MS进行分析，因为GC-MS使用EI源，得到的质谱信息多，可以进行库检索。毛细管柱的分离效果也好。如果在300C左右不能汽化，则需要用LC-MS分析，此时主要得分子量信息，如果是串联质谱，还可以得一些结构信息。如果是生物大分子，主要利用LC-MS和MALDI-TOF分析，主要得分子量信息。对于蛋白质样品，还可以测定氨基酸序列。质谱仪的分辨率是一项重要技术指标，高分辨质谱仪可以提供化合物组成式，这对于结构测定是非常重要的。双聚焦质谱仪，傅立叶变换质谱仪，带反射器的飞行时间质谱仪等都具有高分辨功能。
质谱分析法对样品有一定的要求。进行GC-MS分析的样品应是有机溶液，水溶液中的有机物一般不能测定，须进行萃取分离变为有机溶液，或采用顶空进样技术。有些化合物极性太强，在加热过程中易分解，例如有机酸类化合物，此时可以进行酯化处理，将酸变为酯再进行GC-MS分析，由分析结果可以推测酸的结构。如果样品不能汽化也不能酯化，那就只能进行LC-MS分析了。进行LC-MS分析的样品最好是水溶液或甲醇溶液，LC流动相中不应含不挥发盐。对于极性样品,一般采用ESI源，对于非极性样品,采用APCI源。
3、光谱分析
根据物质的光谱来鉴别物质及确定它的化学组成和相对含量的方法叫光谱分析．其优点是灵敏，迅速．历史上曾通过光谱分析发现了许多新元素，如铷，铯，氦等．根据分析原理光谱分析可分为发射光谱分析与吸收光谱分析二种；根据被测成分的形态可分为原子光谱分析与分子光谱分析。光谱分析的被测成分是原子的称为原子光谱,被测成分是分子的则称为分子光谱。
由于每种原子都有自己的特征谱线，因此可以根据光谱来鉴别物质和确定它的化学组成。这种方法叫做光谱分析。做光谱分析时，可以利用发射光谱，也可以利用吸收光谱。这种方法的优点是非常灵敏而且迅速。某种元素在物质中的含量达10^-10(10的负10次方)克，就可以从光谱中发现它的特征谱线，因而能够把它检查出来．光谱分析在科学技术中有广泛的应用。例如，在检查半导体材料硅和锗是不是达到了高纯度的要求时，就要用到光谱分析．在历史上，光谱分析还帮助人们发现了许多新元素。例如，铷和铯就是从光谱中看到了以前所不知道的特征谱线而被发现的。光谱分析对于研究天体的化学组成也很有用。十九世纪初，在研究太阳光谱时，发现它的连续光谱中有许多暗线。最初不知道这些暗线是怎样形成的，后来人们了解了吸收光谱的成因，才知道这是太阳内部发出的强光经过温度比较低的太阳大气层时产生的吸收光谱。仔细分析这些暗线，把它跟各种原子的特征谱线对照，人们就知道了太阳大气层中含有氢、氦、氮、碳、氧、铁、镁、硅、钙、钠等几十种元素。
复色光经过色散系统分光后按波长的大小依次排列的图案，如太阳光经过分光后形成按红橙黄绿蓝靛紫次序连续分布的彩色光谱．有关光谱的结构，发生机制，性质及其在科学研究、生产实践中的应用已经累积了很丰富的知识并且构成了一门很重要的学科～光谱学。光谱学的应用非常广泛，每种原子都有其独特的光谱，犹如人们的“指纹”一样各不相同。它们按一定规律形成若干光谱线系。原子光谱线系的性质与原子结构是紧密相联的，是研究原子结构的重要依据。应用光谱学的原理和实验方法可以进行光谱分析，每一种元素都有它特有的标识谱线，把某种物质所生成的明线光谱和已知元素的标识谱线进行比较就可以知道这些物质是由哪些元素组成的，用光谱不仅能定性分析物质的化学成分，而且能确定元素含量的多少。光谱分析方法具有极高的灵敏度和准确度。在地质勘探中利用光谱分析就可以检验矿石里所含微量的贵重金属、稀有元素或放射性元素等。用光谱分析速度快，**提高了工作效率。还可以用光谱分析研究天体的化学成分以及校定长度的标准原器等。
复色光经过色散系统（如棱镜、光栅）分光后，按波长（或频率）的大小依次排列的图案。例如，太阳光经过三棱镜后形成按红、橙、黄、绿、蓝、靛、紫次序连续分布的彩色光谱。红色到紫 色，相应于波长由7，700—3，900埃的区域，是为人眼所能感觉的可见部分。红端之外为波长更长的红外光，紫端之外则为波长更短的紫外光，都不能为肉眼所觉察，但能用仪器记录。
因此，按波长区域不同，光谱可分为红外光谱、可见光谱和紫外光谱；按产生的本质不同，可分为原子光谱、分子光谱；按产生的方式不同，可分为发射光谱、吸收光谱和散射光谱；按光谱表观形态不同，可分为线光谱、带光谱和连续光谱。
发射光谱分析是根据被测原子或分子在激发状态下发射的特征光谱的强度计算其含量。
吸收光谱是根据待测元素的特征光谱,通过样品蒸汽中待测元素的基态原子吸收被测元素的光谱后被减弱的强度计算其含量。它符合郎珀-比尔定律：
A= -lg I/I o= -lgT = KCL
式中I为透射光强度，I0为发射光强度，T为透射比，L为光通过原子化器光程由于L是不变值所以A=KC。
物理原理为：
任何元素的原子都是由原子核和绕核运动的电子组成的，原子核外电子按其能量的高低分层分布而形成不同的能级，因此，一个原子核可以具有多种能级状态。
能量最低的能级状态称为基态能级（E0=0），其余能级称为激发态能级，而能最低的激发态则称为第一激发态。正常情况下，原子处于基态，核外电子在各自能量最低的轨道上运动。
如果将一定外界能量如光能提供给该基态原子，当外界光能量E恰好等于该基态原子中基态和某一较高能级之间的能级差E时，该原子将吸收这一特征波长的光，外层电子由基态跃迁到相应的激发态。原来提供能量的光经分光后谱线中缺少了一些特征光谱线，因而产生原子吸收光谱。
电子跃迁到较高能级以后处于激发态，但激发态电子是不稳定的，大约经过10-8秒以后，激发态电子将返回基态或其它较低能级，并将电子跃迁时所吸收的能量以光的形式释放出去，这个过程称原子发射光谱。可见原子吸收光谱过程吸收辐射能量，而原子发射光谱过程则释放辐射能量。
光谱分如下几种形式：
①线状光谱。由狭窄谱线组成的光谱。单原子气体或金属蒸气所发的光波均有线状光谱，故线状光谱又称原子光谱。当原子能量从较高能级向较低能级跃迁时，就辐射出波长单一的光波。严格说来这种波长单一的单色光是不存在的，由于能级本身有一定宽度和多普勒效应等原因，原子所辐射的光谱线总会有一定宽度（见谱线增宽）；即在较窄的波长范围内仍包含各种不同的波长成分。原子光谱按波长的分布规律反映了原子的内部结构，每种原子都有自己特殊的光谱系列。通过对原子光谱的研究可了解原子内部的结构，或对样品所含成分进行定性和定量分析。
②带状光谱。由一系列光谱带组成，它们是由分子所辐射，故又称分子光谱。利用高分辨率光谱仪观察时，每条谱带实际上是由许多紧挨着的谱线组成。带状光谱是分子在其振动和转动能级间跃迁时辐射出来的，通常位于红外或远红外区。通过对分子光谱的研究可了解分子的结构。
③连续光谱。包含一切波长的光谱，炽热固体所辐射的光谱均为连续光谱。同步辐射源（见电磁辐射）可发出从微波到X射线的连续光谱，X射线管发出的轫致辐射部分也是连续谱。
④吸收光谱。具有连续谱的光波通过物质样品时，处于基态的样品原子或分子将吸收特定波长的光而跃迁到激发态，于是在连续谱的背景上出现相应的暗线或暗带，称为吸收光谱。每种原子或分子都有反映其能级结构的标识吸收光谱。研究吸收光谱的特征和规律是了解原子和分子内部结构的重要手段。吸收光谱首先由J.V.夫琅和费在太阳光谱中发现（称夫琅和费线），并据此确定了太阳所含的某些元素。
具体的元素光谱：红色代表硫元素，蓝色代表氧元素，而绿色代表氢元素。
China光谱网核心介绍：光谱学是光学的一个分支学科，它主要研究各种物质的光谱的产生及其同物质之间的相互作用。光谱是电磁辐射按照波长的有序排列，根据实验条件的不同，各个辐射波长都具有各自的特征强度。通过光谱的研究，人们可以得到原子、分子等的能级结构、能级寿命、电子的组态、分子的几何形状、化学键的性质、反应动力学等多方面物质结构的知识。但是，光谱学技术并不仅是一种科学工具，在化学分析中它也提供了重要的定性与定量的分析方法。
4、色谱、质谱、光谱分析优势与不同
简而言之：
质谱：定性、定量，可以推测物质的组成；
色谱：定量，可分辨样品中的不同物质；
光谱：定性，确定样品中主要基团，确定物质类别。

光谱法和色谱法的区别：
（1）分析速度较快，原子发射光谱用于炼钢炉前的分析，可在l～2分钟内，同时给出二十多种元素的分析结果；
（2）操作简便有些样品不经任何化学处理，即可直接进行光谱分析，采用计算机技术，有时只需按一下键盘即可自动进行分析、数据处理和打印出分析结果。在毒剂报警、大气污染检测等方面，采用分子光谱法遥测，不需采集样品，在数秒钟内，便可发出警报或检测出污染程度；
（3）不需纯样品，只需利用已知谱图，即可进行光谱定性分析。这是光谱分析一个十分突出的优点；
（4）可同时测定多种元素或化合物　省去复杂的分离操作；
（5）选择性好可测定化学性质相近的元素和化合物。如测定铌、钽、锆、铪和混合稀土氧化物，它们的谱线可分开而不受干扰，成为分析这些化合物的得力工具；
（6）灵敏度高可利用光谱法进行痕量分析。目前，相对灵敏度可达到千万分之一至十亿分之一，绝对灵敏度可达10-8g~10-9g；
（7）样品损坏少可用于古物以及刑事侦察等领域。
随着新技术的采用（如应用等离子体光源），定量分析的线性范围变宽，使高低含量不同的元素可同时测定。还可以进行微区分析。
色谱法与光谱、质谱相比：
（1）光谱、质谱用于物质定性鉴定，色谱法定性功能差；
（2）色谱法最主要的特点是适用于多组分复杂混合物的分离分析；
（3）色谱仪价格比分子光谱、质谱仪低的多，适用范围广；
（4）色谱检测器比分子光谱法灵敏度更高，比质谱灵敏度低。
光谱定量的局限性：
光谱定量分析建立在相对比较的基础上，必须有一套标准样品作为基准，而且要求标准样品的组成和结构状态应与被分析的样品基本一致，这常常比较困难。
光谱分析仪的优点：
（1）采样方式灵活，对于稀有和贵重金属的检测和分析可以节约取样带来的损耗。
（2）测试速率高，可设定多通道瞬间多点采集，并通过计算器实时输出。
（3）对于一些机械零件可以做到无损检测，而不破坏样品，便于进行无损检测。
（4）分析速度较快，比较适用做炉前分析或现场分析，从而达到快速检测。
（5）分析结果的准确性是建立在化学分析标样的基础上。
光谱分析仪的缺点：
（1）对于非金属和界于金属和非金属之间的元素很难做到准确检测。
（2）不是原始方法，不能作为仲裁分析方法，检测结果不能做为国家认证依据。
（3）受各企业产品相对垄断的因素，购买和维护成本都比较高，性价比较低。
（4）需要大量代表性样品进行化学分析建模，对于小批量样品检测显然不切实际。
（5）模型需要不断更新，在仪器发生变化或者标准样品发生变化时，模型也要变化。
（6）建模成本很高，测试成本也就比较大了，当然对于大量样品检测时，测试成本会下降。
（7）易受光学系统参数等外部或内部因素影响，经常出现曲线非线性问题，对检测结果的准确度影响较大。
质谱法特点：
唯一可以确定分子量的方法，特别是现代生物质谱，适用于生物大分子分子量（数十万）定；具有极高灵敏度，检测限达10-14g。
质谱法应用：
质谱最重要的应用是分离同位素并测定它们的原子质量及相对丰度。测定原子质量的精度超过化学测量方法，大约2／3以上的原子的精确质量是用质谱方法测定的。质谱方法还可用于有机化学分析，特别是微量杂质分析，测量分子的分子量，为确定化合物的分子式和分子结构提供可靠的依据。由于化合物有着像指纹一样的独特质谱，质谱仪在工业生产中也得到广泛应用。
色谱、光谱、质谱都有各自的优缺点，为了能够最大限度的发挥每种分析仪器的最大优势，可将两种或三种仪器进行联用来分析样品，联用技术能够克服仪器单独使用时的缺陷。是未来分析仪器发展的趋势所在。
第二节 色谱分析
一、        色谱概论
色谱区别于其他分析方法的特点：一次进样完成分离与测定，同时进行多组分的定性定量测量。
1、提高分离度R的方法：



Ⅰ. 容量因子k(流动相流速，柱温)


       在k=0-5时，利用保留作用提高R是最有效的，一般要求不超过10，否则会**延长分析时间。
1）        LC中最重要的是改变流动相的组成。
2）        调节柱温。有可能改变流出顺序。GC中降低柱温可以提高k。
3）        GC中可通过降低载气流速提高k
Ⅱ. 选择性α（流动相和固定相组成，柱温）



1）        改变流动相组成、种类和pH
2）        调节柱温
3）        改变固定相
4）        采用化学改性剂
Ⅲ. 柱效N（柱质量，柱长，温度，流动相）H=A+B/u+Cu
1）        涡流扩散项：
用粒度分布较窄的填料
用小的粒度（要适中）
小孔径柱子
减少排列的不紧密及死体积
2）        分子扩散项：（在LC中作用小）
使用重载气
减小柱温
增大流速
3）        传质阻力项：
减小粒径
流动相粘度小、流速小
固定相膜涂薄、均匀、低粘度
升高柱温
轻载气
4）        适当增加柱长
5）        柱外体积小
Ⅳ. 柱外体积的影响（尤其是小内径柱子和HPLC上）
   柱外效应：从进样系统到检测器之间色谱柱以外的流路部分，由于进样方式、柱后扩散等因素对柱效能产生的影响。
Ⅴ. 程序升温和梯度洗脱
   程序升温：在分离过程中柱温随时间改变
  （组成简单的样品最好用恒温分析，这样分析周期会短一些，特别是用填充柱时，恒温分析时色谱图的基线要比程序升温时稳定得多。对于组成复杂的样品，常需用程序升温分离，因为在恒温条件下，如果柱温较低，则低沸点组分分离得好，而高沸点组分流出时间会太长，造成峰展宽，甚至滞留在色谱柱中造成污染；反之，当柱温太高时，低沸点组分难以分离。）
   梯度洗脱：在分离过程中流动相组成随时间改变
2、色谱理论新进展：Poppe Plot 理论阐明了粒度与分离时间、N和柱压降的关系
Ⅰ. 柱长↑，N↑，但是峰容量不一定大
Ⅱ. 填料粒度越小越好
柱压降&填料粒度、柱长、分析时间的关系：
粒度小→N高→R高→峰容量大
粒度小→柱压降大→柱长短→分析时间短
      2）根据对N的要求选择粒径，同等N下粒径小会使分析时间**增加
3、流动相：运载样品通过色谱柱的相
4、固相微萃取（SPE）:属液固分离，待测物质从液相被萃取到固相，再用很少的溶剂洗脱下来，固相萃取柱的原理与色谱分离相同。不仅快速，且节约了溶剂，避免了浓缩步骤。
5、色谱定量需要用标准品的原因：绝大部分色谱检测器上，相同浓度的不同化合物在同一分析条件下、同一检测器上得到的峰面积或峰高往往是不相等的，故必须用标准样品进行校准，方可得到准确的定量分析结果。
6、判断出峰顺序
PEG-20M（强极性）:环己烷，正辛烷，苯；丙同、乙醇、异丙醇（氢键）
OV-1（非极性）：丙同（56.5）、异丙醇（82）、异辛烷（99.2）
CZE pH3:苯胺、甲苯、苯甲酸；苯胺、苯甲酸乙酯、萘甲酸
C18：硫脲、对硝基氯苯、甲苯；硝基甲苯、氯苯、二甲苯
7、色谱的活的灵魂：寻找物质间的差异，必要时创造差异，并利用差异达到使物质分离的目的。
二、        GC
缺点：对未知物的定性比较困难。
解决办法：与其它分析方法联用（质谱、红外和电化学等）
1、        GC的两种类型：填充柱和毛细管柱（按色谱柱分类）；气固色谱和气液色谱（按固定相分类）；分配色谱和吸附色谱（按分离机理分类）。
Ⅰ. 毛细管柱的优缺点
1）        优点：比填充柱分离效率更高（没有固体填料，气阻小，故可采用较长的柱子和较小的柱内径及较高的载气流速），消除了涡流扩散同时减小了纵向扩散造成的谱带展宽。采用较薄的固定液膜又在一定程度上抵消了由于载气流速增大引起的传质阻力增大。
2）        缺点：柱容量小，且对进样技术要求高，载气流速的控制要求更精确，进样量过大易造成柱超载，因而对检测器灵敏度要求高。
3）        对永久气体的分析，填充柱（包括填充毛细管柱）的分离能力更强。
Ⅱ.气固色谱——吸附机理：固体固定相，如多孔氧化铝高分子小球，主要用于永久性气体和M较低的有机化合物。
气液色谱——分配机理：液体固定相，90%以上分析基于此。
2、        保留机理：
Ⅰ.强极性固定液（如PEG-20）
  极性小的先出峰；极性相似的，沸点低的先出峰。
Ⅱ.弱极性固定液（如OV-1，OV101，SE-30）[注：OV的其他型号是有极性的]
  沸点低的先出峰；沸点相近的分不开。
3、        进样方式（应考虑的问题有：样品的稳定性；进样口对峰展宽的影响等）
Ⅰ.分流进样：操作简单，但有分流歧视，样品可能分解。
Ⅱ.不分流进样：操作复杂一些，但分析灵敏度高，常用于痕量分析。
Ⅲ.冷柱上进样：样品以液体状态直接进入色谱柱，无分流歧视问题。分析精度高，重现性好。适用于沸点范围宽或不稳定的样品，也常用于痕量分析（也可做柱上浓缩）。
Ⅳ.程序升温气化进样：分流/不分流进样与冷柱上进样的结合，适应性更强，灵活性更好。
Ⅴ.大体积进样：程序升温气化或冷柱上进样口，配合以溶液放空功能。
Ⅵ.顶空进样：通过样品基质上方的气体成分来测定这些组分在原样品中的含量，只取气相易挥发组分，**减少了样品基质对分析的影响。
Ⅶ.裂解进样：在严格控制的高温下将不能气化或部分不能气化的样品裂解为可气化的小分子化合物，进而用GC分析，适用于聚合物样品。
对热不稳定的化合物，最好采用冷柱进样技术，对于热稳定的严谨，分流/不分流进样。
4、        隔垫吹扫功能
原因：进样隔垫一般为硅橡胶材料制成，不可避免的含有一些残留溶剂和低分子聚      合物；由于气化室高温的影响，硅橡胶会发生降解产生硅氧烷→鬼峰
5、        分流歧视：指一定分流比条件下，不同样品组分的实际分流比是不同的。
Ⅰ.原因：
1）        不均匀气化（主要原因）
2）        不同样品组分在载气中的扩散速率不同，而扩散速率与温度成正比。
Ⅱ.消除方法：
1）        较高的气化温度
2）        色谱柱的初温应高
3）        分流比小更有利
4）        使用合适的衬管
5）        色谱柱安装：柱入口端超过分流点，且处于气化室衬管的中央。
6、        程序升温：分离过程中温度随时间改变
7、        尾吹气：FID作为检测器时从色谱柱出口直接进入检测器的一路气体，由于毛细管柱内载气流量太低，为满足火焰灵敏度对氢气、空气和氮气比率的要求而增加氦气作为尾吹气。填充柱不用尾吹气，而毛细管柱大多采用尾吹气。
作用有：
Ⅰ.调节气体比例，提高检测灵敏度。
Ⅱ.维持火焰稳定。
Ⅲ.毛细管柱载气流速低，样品流出色谱柱后可能因体积膨胀而导致谱带展宽，尾吹气起到包裹、加速的作用，可消除这种柱外效应。
8、        GC载气：
H2：M小，传质阻力项影响小，热导率大，使用热导检测器（TCD）时灵敏度高
N2：M适中，容易调节流速，成本低
He：M小，传质阻力项影响小
Ar：M大，分子扩散项影响小
不能用干燥空气作载气，因为空气成分多，而不纯的气体会使检测器的噪音增大，降低检测灵敏度，缩小线性范围，还可能对色谱柱性能有影响。
9、        检测器
1）        火焰离子化检测器（FID）：质量型，准通用型，对CH化合物的灵敏度高
2）        热导检测器（TCD）：浓度型，通用型，适用于各种无机气体和有机物的分析，多用于永久气体的分析。
3）        电子俘获检测器（ECD）：浓度型，选择型，适合分析含电负性元素或基团的有机化合物，多用于分析含卤素化合物。
4）        氮磷检测器（NPD）：质量型，选择型，适合于含氮和含磷化合物的分析。
5）        火焰光度检测器（FPD）：浓度型，选择型，适合于含硫、含磷和含氮化合物的分析。
10、二维色谱：采用合适的调制器将两个色谱柱连接起来，第一级色谱分离后的组分可以转移到第二级色谱中继续分离。
中心切割：仅将第一级色谱中未分离开的组分送入二级色谱进行分离，分离能力可表示为n+m。
全二维色谱：将第一级色谱的所有组分都送入第二级色谱，且两柱的分离机理往往不同，分离能力可表示为n﹡m。
11、反吹的优点：效率高；延长柱使用寿命；降低检测器污染；降低操作成本；减少仪器维护频率；背景干扰小，数据可靠。
12、GC-MS：适宜分析小分子、易挥发、热稳定、能气化的物质。

1）GC对MS的要求：
分子结构鉴定能力
快速响应能力
不损失分离度
高灵敏度
在线联用
2）接口：
   喷射式分离器：分离除去大部分载气，使试样组分浓集；同时使其达到质谱的真空度。
   开口分流型：色谱流量大时，传输能力较低，不适用于填充柱条件
   毛细管直接连接：无死体积，无选择性，受柱容量限制。
3）GC载气的选择
   Ⅰ.化学惰性，不干扰质谱图；
   Ⅱ.不使用N2：（电离能15.6eV，和一般有机物接近），对总离子流有干扰；其分子离子峰信号较强，接近通常MS扫描起始质量；
   Ⅲ.使用He：电离能24.6eV，对TIC干扰小；分子离子峰不影响低质量区
   Ⅳ.高纯
4）色谱柱和隔垫本底：色谱柱中固定相、隔垫残渣主要成分都是硅氧烷的聚合物，在高温下分解通常称为“流失”，这种流失进入离子源，是GC-MS质谱图中背景的主要来源。
   消除方法：选择耐高温、低流失的隔垫，常换隔垫，防止隔垫碎屑进入衬管

三、        HPLC
1、        按吸附机理分：
Ⅰ.吸附色谱（液固色谱）：针对弱极性和中等极性的化合物，以及同系物的分离。
Ⅱ.分配色谱：又分为液液分配色谱和键合相分配色谱
1）        正相HPLC：弱极性到中等极性，异构体
固定相极性>流动相极性，极性小的先出峰。
2）        反相HPLC：强极性，同系物和苯系物，也可适用于离子化的酸性或碱性化合物（离子对HPLC）。很难分析胺和不溶于水的化合物。
固定相极性<流动相极性，极性大的先出峰。
极性判断顺序：-CONH->-OH,-NH2>-C=O>-NO2>-O->-X>芳烃>-CH3;
              C数↓，不饱和度↑，支链↑，则极性↑。
      Ⅲ.离子交换色谱（IEC）：有机或无机离子。按照荷电基团进行可逆性离子交换的能力的差异进行分离。
      Ⅳ.体积排阻色谱（SEC）：用于M>2000的聚合物和生物大分子。
         大分子先出峰。
      Ⅴ.亲和色谱（AC）：生化分析和药物筛选
2、        梯度洗脱：在分离过程中改变流动相组成，后期逐渐增加有机改性剂的含量，分配转移到流动相，增加化合物的流速，尾部的速度比峰中心快，使峰聚焦。
优点：改善峰形和分离度，提高分离能力；提高检测灵敏度；缩短分析时间；降低由于强保留组分而使色谱柱性能变差的可能性
缺点：有时引起基线漂移；强保留添加剂不适用；离子对色谱不适用；裸硅胶柱上正相HPLC，部分检测器不适用
3、        色谱柱封端（填料封尾）：加入小分子的硅烷化试剂，与固定相硅胶基体表面上残留的硅羟基或氨基反应，使其表面惰性更好，对碱性化合物的吸附作用**减小，减少了二次保留作用，改善分离效果。分单体键合与聚合键合（惰性更好）
4、        离子抑制技术：在反相HPLC中加入改性试剂以控制流动相的酸碱性，达到改善色谱峰形，提高分离度的目的。分析弱酸时加入三氟乙酸，分析弱碱时加入三乙胺。
5、        提高α的方法：见第一部分
6、        检测器
7、        紫外可见（UV-Vis）检测器：适用于绝大多数物质，可进行梯度分析，缺点是要求流动相无吸收。
示差折光检测器：适用于检测碳水化合物，不可进行梯度洗脱，且受温度、压力、流速影响大；灵敏度低，检测限高。
电导检测器（ECD）：选择性检测器，在离子色谱中广泛应用。不适用于梯度洗脱。
荧光检测器（FLD）：高灵敏度，高选择性。适用于芳烃、甾族、氨基酸、维生素、酶、蛋白质的检测，可进行梯度洗脱；受温度、流速变化影响小，灵敏度高；缺点是只能用于荧光活性物质检测。
蒸发光散射检测器（ELSD）：通用型检测器，灵敏度比示差折光检测器高1-2个数量级，主要应用于糖检测；缺点是操作复杂，成本高。
8、        HPLC对流动相的基本要求：
1）        纯度高
2）        与固定相不互溶，以避免固定相的降解和塌陷
3）        对样品有足够的溶解度，以改善峰形和灵敏度
4）        粘度低，以降低传质阻力，提高柱效
5）        与检测器兼容，以降低背景信号和基线噪音
6）        毒性小，安全性好
9、        HPLC的应用
1）M>2000的样品需用SEC（体积排阻色谱）分离，脂溶性大分子用GPC（凝胶渗透色谱）、水溶性大分子用GFC（凝胶过滤色谱）
2）对于M<2000的化合物，若极性较弱，可采用吸附色谱法或正相键合色谱法
3）分离位置异构体如苯的取代位置异构体一般用吸附色谱法
4）分离同系物则多用分配色谱法
5）若是强极性混合物，则多用反相键合色谱分离
6）对于弱酸性或弱碱性化合物，用反相离子对色谱
7）离子型化合物用离子交换色谱
8）生物大分子可用亲和色谱法
10、HPLC和GC的比较
        HPLC        GC
样品挥发性        没有挥发性要求
样品必须溶于流动相        样品必须是可挥发的
样品极性        可分离极性和非极性化合物
从多环芳烃（PAH）到无机离子        样品是非极性（大部分）和极性（少）的
样品的热稳定性        分析可在室温或低于室温条件下进行        样品必须能经受进样口和色谱柱的高温
样品的分子量        没有理论上限，但实际上，溶解度是一个限制        典型的分子量<500amu
样品制备        样品必须经过滤
样品溶剂应与流动相相同        溶剂必须是可挥发性的，且其沸点一般要低于被分析物的沸点
样品量        取决于色谱柱内径        典型的进样量：1-5μL
分离机理        固定相与流动相都参与分离        流动相只是样品的载体
检测器        常用UV-Vis        常用FID

四、        CE
1、        电渗流（EOF）：毛细管内壁表面电荷所引起的管内液体的整体流动，来源于外加电场对管壁溶液双电层的作用。
电渗流具有“塞状”的平面流型，由于引起流动的推动力在毛细管壁的径向上均匀分布，所以管内各处流速接近相等。其优点是径向扩散对谱带扩展的影响非常小。
一般电渗流的方向从正极到负极，加入阳离子表面活性剂后，可使电渗流方向发生改变。
2、        CE比GC和LC的分离效果好的原因：
Ⅰ. CE采用熔融石英毛细管柱，限制了电流的产生和管内发热，并采用柱上检测，**消除了柱外效应，理论塔板数很高。
Ⅱ. 电渗流具有平面流型，径向扩散对谱带扩展的影响非常小。
3、        所有模式CE的致命缺点：由于柱容量小，CE以浓度表示的检测灵敏度较低，且重复性不好。（CE不能取代传统色谱的主要原因）
4、        几种模式：
Ⅰ.CZE（毛细管区带电泳）
1）        应用范围：阴阳离子、手性化合物、氨基酸、多肽、蛋白质等
2）        原理：在电场作用下，样品组分以不同速率在独立的区带内进行迁移而被分离。由于电渗流作用，正负离子均可被分离，中性物质随电渗流一起流出而得不到分离。
3）        分离依据：离子淌度的差异
4）        出峰顺序：以电渗流方向从正极到负极为例（正极进样），pKa↑，碱性↑，越先出峰。（正离子→中性物质→负离子）
Ⅱ. MEKC/MECC（毛细管胶束电动色谱）
1）        应用范围：中性或强疏水性化合物，核酸、多环芳烃、结构相似的肽段
2）        原理：将高于CMC的离子型SAa加入缓冲液中形成胶束（假固定相），被分析物在胶束和水相中进行分配。
3）        分离依据：中性化合物——分配系数的差异；带电组分——电泳和色谱结合
4）        出峰顺序：中性分子按照疏水性的不同，亲水的先出。
Ⅲ. CEC（毛细管电色谱）
1）        应用范围：同HPLC
2）        原理：在毛细管中填充或在 管壁涂布、键合类似HPLC的固定相，在毛细管两端加直流电压，以电渗流代替高压泵推动流动相。
3）        Vs HPLC的优点：**降低了柱压降（因为表面上每个硅羟基都产生电渗流提供推动力，流体阻力小），可以使用粒径更小的填料；具有塞状的平面流型，抑制谱带展宽，分离效率高。
Ⅳ. CGE（毛细管凝胶电泳）
1）        应用范围：蛋白质和核酸等生物大分子，如DNA测序。
2）        原理：在毛细管中填充聚合物凝胶，当带电被分析物在电场作用下进入毛细管后，聚合物起着分子筛的作用，小的分子容易进入凝胶而首先通过凝胶柱，大分子则受到较大的障碍而后流出凝胶柱。
3）        分离依据：分子体积大小。
4）        出峰顺序：小分子先出，大分子后出。
5）        问题：
a)        填充凝胶在使用数百次后失效，重现性差。
改进：在流动相缓冲液中保存线性聚丙烯酰胺，每次进样前通入缓冲液使凝胶充满管子，可以提高重复性和使用寿命。
b)        表面硅羟基对分离也产生作用，使出峰顺序不完全取决于分子大小
改进：在管壁上涂聚乙二醇使其成为涂渍管，覆盖住-SiOH。
Ⅴ. CIEF（毛细管等电聚焦）
1）        应用范围：蛋白质、多肽。
2）        原理：利用两性电解质在毛细管内建立起pH梯度，压力驱动下进样，施加电场后蛋白质停留在pH=pI的位置，再用压力驱动将各个区带推出毛细管进行检测。
3）        出峰顺序：等电点pI高的先出。
4）        问题：同CGE的问题b。
注意：以上两种分离模式只是利用毛细管，用压力进行驱动，并都希望减少EOF的影响。
Ⅵ. CITP（毛细管等速电泳）
1）        应用范围：同CZE，电泳分离的预浓缩
2）        原理：前导缓冲液的μ>所有样品离子>尾随缓冲液，在外加电场作用下，运动平衡后样品区带匀速运动。缓冲液离子强度>样品，样品区带的电导率低，局部电场强度大，在高电场作用下，淌度高的在前，淌度低的在后，使样品分离。
3）        用途：在线样品浓缩（柱上浓缩）
5、        进样方式
Ⅰ. 压差进样：分为正压力进样、负压力进样、虹吸进样。
Ⅱ. 电动进样：依靠电渗流将样品带入毛细管。存在进样歧视，即由于各组分的电渗淌度不同导致进入毛细管的样品组成与原来样品的组成不同。若不经过校准，误差大于压差进样。
6、        检测器
Ⅰ.UV
1）        柱上检测，因此检测池{即毛细管}是圆柱形的，入射面是曲面；不同于一般方形样品池（入射面是平面）。因此线性范围小，噪声高。解决方法有：Bubble池和Z型池
2）        间接UV检测方法：分析物没有紫外吸收性质时，在分离介质中加入具有紫外吸收光性质的物质，造成很强的背景吸收，当样品组分流过检测窗口时出现负峰，通过极性转换即可得到正常的电泳图。
3）        检测歧视：不同组分的区带在毛细管电泳中迁移速率不同，通过检测窗口的速率也不一样，导致吸光系数相等、浓度相同的组分所得峰面积不相等，故需要标准样品校准。
Ⅱ.LIF（激光诱导荧光）
  是CE检测器中灵敏度最高的，但并不是所有样品都有荧光，需要衍生化。
Ⅲ.电化学检测器：柱后检测
7、        CE-MS的三种接口类型：鞘液型、无鞘液型、液接型
鞘液型优点：喷雾更加稳定、形成电流回路、可改变缓冲溶液组成
鞘液型缺点：会稀释待测物、电接触
8、        如何提高灵敏度：
优化电泳条件
柱上浓缩
用高灵敏度检测器：LIF、MS
9、        如何提高重现性：
每次灌胶
毛细管涂渍技术（PFG,PVA）
严格控制每次的条件参数一致，如温度等

五、        薄层色谱基础知识
一 、绪论及色谱分析的发展
薄层色谱是色谱分析技术中的一项重要分支。由于这一方法具有简单、迅速、灵敏高度、分离效能好等优点，因此已广泛一应用于化学分析的多种领域。目前在食品卫生化学分析中，也多采用薄层色谱技术，特别是对食品中的微量有机毒物的分离和分析，更显出薄层色谱的优越性，故已成为食品卫生化学分析中的一项重要技术。
色谱分析是分离混合物组分的一种方法。这种方法是借助于混合物中的组分，在互不相容的两组间进行吸附或分配，以达到分离的目的。本世纪初，植物学家茨维特（Tsw-ett）用菊根粉柱及石油醚分离植物叶子提取物，结果在菊根粉柱上形成了几种植物色素的色谱带，从而分离出植物叶子中的各种色素。这种分离分析的方法，被称为色谱分析法，茨维特因此而被认为是色谱分析的奠基人。但这一方法在较长的时期内并没有被人们所重视。直至1931年以后，人们在应用色谱分析方法分离类胡萝卜素等工作中，提出了色谱分析的原理及其实用价值的报告，于是才逐步完善了这一技术方法，促进了色谱分析的发展。
茨维特所建立的色谱分析方法，被称为液一固吸附色谱法。这种方法是将溶解了的待分离组分的溶液，通过固体吸附剂柱，进行分离。1941年马丁（Wartin）等人，用含有水份的惰性支持剂（如含水硅胶）代替液一固吸附色谱中的固体吸附剂，将样品溶于不溶于水的有机溶剂中，并使通过装有含水的惰性支持剂柱，由于被分离的各组分在有机溶剂及水之间的溶解度不同，从而在两相间进行分配分离，这就诞生了液一液分配色谱。此后，康斯登（Consden）用滤纸代替含水硅胶作隋性支持剂，称之为纸色谱。
马丁等进一步将色谱分离系统中的流动相由液体改为气体，并在涂有硅铜油液体的硅藻土支持剂上成功地分离了脂肪酸，创建了一种新型的色谱分析方法。由于这一方法具有分离效能高、速度快等优点，因而得到了迅速的发展，成为目前色谱分析中的一项重要的技术——气相色谱法。
五十年代中期，斯塔尔（Stahl）发展了一种新型的色谱分析技术——薄层色谱法。
由于色谱分析中所用静相物质的不同，于是产生了另外两种色谱分析方法：（1）离子交换色谱。这种方法是以离子交换树脂为色谱分析中的静相，利用交换树脂中的极性化学键，使被分离物质在两相之间形成可逆的反应。（2）凝胶透过色谱。这种方法是用分子筛为静相，用以分离分子大小不同的化合物。
二，色谱分析分类
色谱分析不断发展，出现了多种类型的色谱技术方法，而任何一种色谱分析，被分离的组分都是在两相间进行分离。其中一相是一种含有很大表面积的静止的物质，称为“静相”；而另外一相是通过或者沿着静相的表面流动的物质，称为“动相”。静相可以是固体，也可以是液体（这种液体是附着在惰性支持剂上）；动相可以是液体，也可以是气体。根据每一相的两种可能在色谱分离中所处的状态，可将色谱法分为四种基本类型，即气固色谱、气液色谱、液固色谱、液液色谱，如图1—1所示。但这一分类方法无法表示色谱分离的性质，
图1—1色谱法分类图
        动      相
        气体        液体
静


相        固

体         
气—固色谱        吸附柱色谱

薄层色谱
        液

体         
气—液色谱        分配柱色谱
薄层色谱
纸色谱
因而有人提出按色谱分离过程的物理和化学性质分类的方法：                  （一）吸附色谱：静相为固体吸附剂，包括气固吸附色谱及液固吸附色谱。利用固体吸附剂对混合物中各组分在吸附性能的不同，达到分离的目的。
（二）分配色谱：静相为附着在担体上的液体，包括气液分配色谱及液液分配色谱。利用混合物中各组分在两相中的溶解度不同而有着不同的分配系数，从而进行分离。
（三）离子交换色谱：静相为离子交换树脂。利用交换树脂中的极性化学键，使被分离的物质在两相间形成可逆的反应，达到分离混合物的目的。
（四）凝胶过滤色谱：静相为分子筛。利用混合物中各组分的分子大小的差异，使通过分子筛静相，进行分离。
三，薄层色谱简述
早在1938年依斯迈洛夫（Izmailov）等人在试图将柱色谱的管柱内径缩小到1毫米，从而建立一种“微柱色谱”的工作失败以后，考虑到一种开放式的微柱色谱法。   
这种方法是在涂有氧化铝薄层的玻璃板上分离药用植物提取液内的生物碱。当时仅用几滴样品溶液，因此称之为“点滴色谱”。继后，人们用这一方法成功地进行了萜、烯等植物挥发油的分离，这一方法才有所发展，被称为“带色谱法”或“板色谱法”。
五十年代初，克尔希内（Kirehner）发展了依斯迈洛夫的方法，但目前广泛使用遥薄层色谱技术，应归功于斯塔尔的工作。他在研究植物细胞组成的过程中，探索了高灵敏度的微量分离方法，详细地研究了以往的微量色谱技术，并将依斯迈洛夫提出的色谱方法中的仪器、吸附剂以及操作条件等标准化，使这一方法进一步发展成为一种新的色谱分析技术。斯塔尔称这种方法为“薄层色谱法”（简称TLC）。
薄层色谱实际上是柱色谱的一种改良，薄层板可以认为是一个开放的色谱柱。但就技术操作来看，又很类似纸色谱。
根据薄层色谱所使用的静相物质的性质，可将薄层色谱分为以下几类：
（1）吸附薄层色谱
（2）分配薄层色谱
（3）离子交换薄层色谱
（4）凝胶过滤薄层色谱
目前由于薄层色谱不断地发展，这一微量分离技术已显示出比纸色谱法更具有应用价值。其特点如下：
（1）混合物展开分离迅速。一般展开一次约在15—60分钟，而纸色谱多在几小时至十几小时，因此薄层色谱法更适于快速鉴定。
（2）分离效能比纸色谱好。由于展开距离比较短，因此斑点比较致密。
（3）样品溶液需要量少。一般为1微升至几十微升。
（4）操作简便。不需要特殊昂贵而又复杂的仪器，便于普及。
（5）灵敏度高。与纸色谱比较，其灵敏度约高10—100倍。
（6）受温度变化影响不大。因展开时间较短，不象纸色谱难于控制温度。
（7）可以使用强腐蚀性的显色剂。因静相物质多为隋性无机化合物，所以可以使用浓硫酸、浓硝酸、氢氧化钠等强腐蚀性显色试剂。这是纸色谱法所不及的。
（8）薄层色谱的分离容量较纸色谱为大，因此用作微量物质分离的制备色谱，较纸色谱为好。
（9）可以作为一种纯化手段，与气相色谱、红外分光光度等方法联用。
薄层色谱虽然有以上优点，并在色谱分析领域内构成了独特的一个分支。但事物总是一分为二的，薄层色谱也有不足之处。首先，限于操作条件，标准化不易严格控制，因此薄层色谱中Rf值重现性不够理想；其次由于薄层板的脆弱性，色谱不易保存；其三挥发性物质及高分子量化合物的应用上还存在着一定的问题等。因此，必须全面、正确地估价这一技术方法。表1—1是各种色谱分析技术在各方面的比较，供参考。

表1—1  各类色谱分析技术的比较
方    法        分离时间        分离效能        含量测定        分    离    情    况
                                挥发性物质        非挥发性物质        高分子物质
纸色谱
薄层色谱
气相色谱
液固柱色谱
凝胶过滤色谱
离子交换色谱
毛细管电泳
电泳        长
短
短
短
中
短
短
长        中
中
特高
高
中
高
高
中        差
差
很好
好
好
好
很好
差        无用
无用
可用
可用
无用
可用
可用
无用        可用
可用
无用
可用
可用
可用
可用
可用        差
差
无用
差
可用
无用
可用
可用

四，原理
薄层色谱是柱色谱的改良，即开放式的柱色薄，而同时又类似纸色谱的操作技术。因此色谱法的一般原理对于薄层色谱也是适用的。在色谱分析中，主要是动相溶剂带动混合物组分流经静相（即色谱柱、薄层板、滤纸等）的过程。根据静相的性质，使被分离的组分基于以下的一种或几种因素，在动相与静相间进行分配，从而达到分离的目的。
（1）在静相的表面或内部所持有的液体中进行溶解分配。
（2）在静相的表面或孔隙中进行吸附分配。
（3）与静相的离子组分形成极性键。
根据色谱中静相对于被分离物质的作用原理，可将薄层色谱分为四种类型，其原理分别为：
（一）分配薄层色谱：即被分离的物质在动相溶剂与静相中所含有的液体之间进行分配分离。其原理与纸色谱相同，根据被分离混合物中溶质间的分配系数的不同，进而达到分离的目的。分配系数小的溶质，在动相溶解得多，随动相移动的距离就大；分配系数大的溶质，移动的距离就小，因此使不同的化合物得以分离。
（二）吸附薄层色谱：在薄层色谱中，吸附作用也是一种主要的形式。在用动相溶剂展开时，不同的化合物在吸附剂和展开剂之间发生连续不断的吸附、解吸、再吸附、再解吸的现象。
（三）离子交换薄层色谱：离子交换是指在固体颗粒和液体溶剂界面上发生的离子互相交换。离子交换薄层色谱的原理也是基于离子交换的基本原理，应用在薄层色谱操作技术上。在离子交换树脂为静相的薄层板上，点上适量的被分离物质，当用展开溶剂展开时，就发生一系列的洗脱交换和吸留交换现象，随各种离子选择效应的不同，将混合物按一定次序进行分离。在薄层色谱中常用的为离子交换纤维素。
（四）凝胶过滤薄层色谱：凝胶过滤色谱（又称凝胶渗透色谱）是利用分子筛为静相物质，结合薄层色谱的操作技术，进行分离分析混合物各组分的一种方法。凝胶是一种多孔性的物质，在色谱分离过程中，大小不同的被子分离的分子，在不同的程度上渗透入凝胶内网络组织的孔隙内。这种渗透是可逆的，进入孔隙的小分子又可以用淋洗溶剂冲洗出来；不能进入孔隙内的较大的分子，则在凝胶颗粒之间的空间内，很快地被动相溶剂淋洗出来。进入孔隙的小分子被动相溶剂淋洗出来的速度以先大后小的次序而分离。如图2—1所示。总的说来，凝胶色谱是基于凝胶颗粒内孔隙的大小以及被分离化合物分子的大小而分离的。
五，静相物质
薄层色谱中的静相物质主要是一些吸附剂、担体、离子交换树脂、分子筛等，这些物质对薄层色谱分离效果起着重要作用。一般柱色谱常用的静相物质，多数可在薄层色谱中应用，不同的是薄层色谱所用的静相物质的颗粒较柱色谱为细。克尔希内用淀粉为粘合剂系统地研究了一些无机吸附剂，发现以硅胶和氧化铝制成的薄层板分离效果最好，至今仍是薄层色谱中应用最广泛的吸附剂。随着薄层色谱的不断展，近年来还出现了不少应用广泛的有机静相物质，如聚酰胺、纤维素、离子交换纤维素以及凝胶过滤色谱用的多聚葡萄糖凝胶等。以下就常用的静相物质作一简略介绍：
（一）无机静相物质：
（1）硅胶：硅胶是由硅胶酸脱水而成，硅胶是薄层色谱中应用最多的一种吸附剂。硅胶结构具有多孔性，孔隙多在20—150埃之间。孔隙大小和表面面积大小对吸附性能有很大的影响。经实验证明，用于薄层色谱有硅胶，其粒度以200—250目，孔隙在80—150埃为适宜。粒度太粗，分离效果不佳；过细，展开速度较慢。硅胶又有很强烈的吸湿性，在相对湿度为45—75%时，能吸取7—20%的水份，这一性质往往使已活化的硅胶吸水，减低其活度。硅胶颗粒表面有大量的—OH基，带有一定的酸性（pH4—5），故适于酸性或中性物质的分离。相对来说，硅胶更适于分离疏水性物质，而分离亲水性物质的效果较差。硅胶对对玻璃有亲和性，容易附着在玻璃上，也是其优点之一。目前，国内外已有适用于薄层色谱的商品硅胶供应。因此实验室自制硅胶吸附剂已无必要。常见的商品硅胶有以下几种规格：
1）不加粘合剂的硅胶：即适用于薄层色谱的纯硅胶粉。商品称硅胶H或硅胶N。
2）加粘全剂的硅胶：加有15%石膏的硅粉胶，商品称为硅胶G。加有15%淀粉的硅胶，商品称硅胶S。
3）含荧光指示剂的硅胶：这类硅胶粉含有无机荧光性物质，如硫化镉等，在短波紫外线照射下，产生绿色荧光，商品称为硅胶GF254、硅胶Guv254或硅胶HF254。
4）高纯薄层硅胶：商品称硅胶G—HR及硅胶HF—HR。
（2）氧化铝：氧化铝为应用范围仅次于硅胶的一种薄层吸附剂，吸附力很强。吸附率与氧化铝的结构有关，一般比表面积以100—200米2/克为佳。氧化铝的重活化温度在200℃左右，温度过高会减少它的比表面积，而氧化铝的比表面积低于6米2/克就不能用为吸附剂，故氧化铝不能加热到500℃以上，商品氧化铝多为碱性（约pH9），但也有中性（约pH7）、酸性（约pH4）氧化铝。氧化铝薄层板主要用来分离碱性和中性的弱极性化合物。在充分减活化的情况下，也可以分离强亲水性的化合物，如醣类、氨基酸等。商品薄层用氧化铝也常加入粘合剂石膏，这样可使氧化铝的碱性减弱，甚至达到中性，因此在需用碱性薄层板时，应加以注意。常用的氧化铝有：
1）不加粘合剂的氧化铝：即适用于薄层色谱的纯氧化铝粉，商品称氧化铝H，或氧化铝N。
2）加粘合剂的氧化铝：加有石膏的氧化铝商品称为氧化铝G。
3）含有荧光指示剂的氧化铝：商品称氧化铝GF254，氧化铝HF254亦有称氧化铝Guv254。
（3）硅藻土：硅藻土为粗二氧化硅的水合物，由硅藻类的遗骸在海底堆积而成。它的吸附力极弱，但有大量的空腔，因此可以作分配薄层色谱中的惰性支持剂（担体），用来分离亲水化合物。薄层用硅藻土粒度在60毫微米以内，商品硅藻土有不加粘合剂的硅藻土H，加石膏粘合剂的硅藻土G，含有荧光物质的硅藻土GF254。
（4）其它无机物质：除以上三种常用的无机吸附吸附剂外，还有一些吸附剂，如硅酸镁、硅酸钙、碳酸锌、玻璃粉等。这些吸附剂仅用于某些特殊的用途，而不如硅胶、氧化铝广泛应用。
（二）无机静相物质：
（1）聚酰胺粉：聚酰胺为内酰胺的多聚体，其分子内存在着很多酰胺键，可与酚类、酸类等化合物形成氢键，酰胺键内的胺基又可与芳香硝基及醌式化合物中的醌基形成氢键，因此对这些化合物产生了一定的吸附作用，这些化合物与聚酰胺形成氢键能力各不相同，故用聚酰胺薄层板可达到分离效果。聚酰胺特别适用于分离酚类化合物，在分析食品中的色素，防腐剂等均有应用。聚酰胺的粘着能力比其它吸附剂差，故需加入纤维素或淀粉等粘合剂。
（2）纤维素：纤维素是含有大量的β—1，4葡萄糖甙链连接的纤维二糖，由於它含有大量的羟基，使得纤维素有良好的亲水性，因此适用于分离亲水性化合物。纤维素薄层板属于分配色谱。纤维素薄层板与纸色谱中的滤纸类似，所不同的主要是薄层用纤维素较滤纸纤维素为短。一般用纤维素长度在2—200毫微米之间。其比表面积约为1500厘米/克。由於纤维短。故在纤维素薄层板上展开时扩散很小，形成的斑点致密，可以在较短的距离内得到与纸色谱相同的分离效果，因此展开时间较纸色谱为短。但与无机吸附剂比，展开时间又相对较长，此外也存在不能使用腐蚀性显色剂的缺点。
薄层用纤维素有三种类型：
1）天然纤维素：由棉花制成，商品称MN-300，MN-300VU254加荧光物质的纤维素），MN-300HR（高纯MN-300）。
2）结晶纤维素：由盐酸水解天然纤维素而得，商品称Aviecl。
3）乙酰化纤维素：这种乙酰化的纤维素可供反相色谱用，商品有称MN-300AC。
（3）离子交换纤维素：在离子交换薄层色谱中，常用的静相物质为离子交换树脂及离子交换纤维素，后者是将天然纤维素经过酯化、醚化，使纤维中的羟基与一些酸性或碱性基团作用，形成有离子交换性质的纤维素，这些物质对於高分子量化合物的分离效果很好，常用离子交换纤维素及离子交换树脂见表3—1及表3—2。
表3—1常用离子交换树脂
树脂类型        名称        树脂性质        离子型        交换
容量               
强酸性阳离子
交换树脂        Amberlite IR-120
Dowex 50
Zeokarb 225        聚苯乙烯；-SO3-H+
聚苯乙烯；-SO3-H+
聚苯乙烯；-SO3-H+        H或Na
H或Na
H或Na        4．2
4．3
5．0                               
弱酸性阳离子
交换树脂        Amberlite IRC-50        聚丙烯酸；
聚甲丙烯酸        H        10．0                               
强碱性阳离子
交换树脂        Amberlite IRA-400
Amberlite IRA-410
Dowex  1
Dowex  2        季胺
CH2-N（CH3）2CH2CH2OH
聚苯乙烯；-CH2-N（CH3）3
-CH2-N（CH3）2CH2CH2OH        CI
CI
CI
CI        3．3
3．1
3．3
3．3                               
弱碱性阴离子
交换树脂        Amberlite IR-4B
Amberlite IR-45
Dowex  3        聚胺；-NHR，-NR2
聚苯乙烯；-NHR，-NR2
聚苯乙烯；-NHR，-2NR        OH
OH
OH        10．0
5．0
5．5                               
表3-2  常用离子交换纤维素粉
树脂类型        交换基团               
        化学式        名称        缩写符号
强酸性阳离
子交换树脂        -O-CH2-SO3-
-O-CH2-CH2-SO3-        磺甲基
磺乙基        SM
SE
弱酸性阳离
子交换树脂        -O-CH2-COO-        羟甲基        CM
强碱性阴离
子交换树脂        -O-CH2-CH2-N（C2H5）3        三乙胺基乙基        TEAE
弱碱性阴离
子交换树脂        -O-CH2-CH2-NH（C2H5）2
-O-CH2-CH2-NH2
-N（CH2-CH2OH）3        二乙胺基乙基
胺基乙基
三乙醇胺        DEAE
AE
ECTEOLA

（4）亲水性凝胶：多聚葡萄糖凝胶为这一类物质的代表，为一种多联多聚葡萄糖，广为应用在凝胶过滤薄层色谱，商品名称为Sephadex。根据这种凝胶的分子量，把Sephadex分为11种规格，如表3-3所示，一般在G-10至G-25不适于薄层色谱用；在G-50以上可适用于薄层色谱用。粒度比柱色谱所用为细，在10-40微米之间。另外生物胶P（Bio—gelP）也应用在薄层色谱方面。
（5）其他有机物质；淀粉、蔗糖、甘露醇等有机化合物也曾用在薄层色谱上，但已少有应用。
表3-4  常用静相物质的一般性质
名称        酸碱性        吸附活性        分离原理
硅胶
氧化铝
硅藻土
硅酸镁
氢氧化钙
磷酸钙
氢氧化铁
活性碳
纤维素
聚酰胺
离子交换纤维素
多聚葡萄糖胶        酸性
碱性
中性
——
碱性
微碱性
——
——
中性
中性
碱性-酸性
——        强
强
无
弱
弱
强
强
强
无
无
无
无        吸附；分配
吸附；分配
分配
吸附
吸附
吸附
吸附
吸附
分配

离子交换
凝胶过滤

六，粘合剂及其他附加剂
根据薄层色谱的特点，静相物质通常是粘着在完全惰性的的玻璃板上，而单纯的吸附剂在玻璃板上粘着是很困难的，故往往需要加入适当的粘全剂，增进薄层的机械强度及在玻璃板上的粘着能力。另外根据其他的目的，如显谱、分离等，又往往要在吸附剂内加入一些必要的物质，如荧光剂、酸碱溶液等。现就一些常用的粘全剂及附加剂分别介绍如下。
（一）粘合剂
（1）煅制石膏：煅制石膏为薄层色谱中用得最多的一种无机粘合剂，粘全力中等。它是由含二分子结晶水的硫酸钙（CaSO4。2H2O）加热120℃4小时失水而成，失水后的煅制石膏为含半分子结晶不的硫酸钙（CaSO4。1/2H2O）。另热过程中如如温度过高则进一步失水，到200℃以上则完全失水而成无水硫酸钙，并失去可凝固性。煅制石膏与少量水结合时，逐渐硬化并膨胀。以石膏为粘合剂的吸附剂有硅胶、氧化铝及硅藻土。石膏含量在5—15%之间。商品称硅胶G、氧化铝G及硅藻土G。以石膏为粘合剂的优点是不与被分离化合物及显色剂起化学反应，并可使用腐蚀性显色剂。其缺点是粘合力不强，薄层的机械强度较差，容易破裂。但这种粘合力不强的性质，对于薄层的洗脱含量测定及制备薄层色谱又是有利的条件。
（2）淀粉：粘合力中等，但较石膏为强，其据点是容易受到腐蚀性显色剂和与淀粉起化学反应的显色剂的干扰，配制方法也比石膏麻烦。
（3）其它粘合剂：聚乙烯醇、竣甲基纤维素都有可以做薄层的粘合剂。后都有的粘合力强，制成的薄层板机械强度好，耐磨，而且制备简单。但不易取下，影响洗脱含量测定。
（二）附加剂：
（1）荧光物质：在薄层色谱中，荧光猝灭法是一种常见的方法，应用这种方法，需要在吸附剂中加入一些荧光物质。常见的有硫化镉、硅酸锌等。含有荧光物质的薄层板，在短波紫外线（254nm）照射下，产生绿色荧光，而被分离的化合物因荧光猝灭而产生绿色斑点。加有这种荧光物质的薄层板，商品称为硅胶GF254，氧化铝GF254。此外加入罗丹明6G荧光物质的薄层板，在长波紫外线（366nm）的照射下，板底呈蓝色荧光，商品称为硅胶GF366。
（2）其它吸附剂：根据被子分离物质的特殊需要，如增进分离效果、提高反应灵敏度等，可加入适当的吸附剂。如在吸附剂中加入硼酸，可以增进碳水化合物异构体的分离，因为硼酸可以与这些异构体形成络合物；加入硝酸银的薄层板，有助于分离不饱合化合物。又如用稀酸或稀碱代替蒸馏水制板，前者称酸性薄层板，可以分离酸性物质，如酚类、有机酸；后者称碱性薄层板，可分离有机碱及有机胺。
七，动相溶剂
薄层色谱中展开溶剂的选择，对於成功地进行薄层分离是非常重要的。因为在吸附剂、被分离物质及展开溶剂三因素中，前二者的性质在一定条件下是固定的，所以展开溶剂的性质将对薄层分离效果有重要影响。在用硅胶、氧化铝及其他无机吸附剂进行吸附薄层色谱分离时，溶剂系统选择的原则与吸附柱色谱类似。其中最重要的是展开溶剂的极性。一般说来，中等极性的被分离物质，需用中等活性的吸附剂及中等极性的展开溶剂；非极性的被分离物质，需要用高度活性的吸附剂及非极性展开溶剂；极性的被分离物质，用低活性的吸附剂及强极性的展开溶剂。展开溶剂的选择要考虑到被分离物质极性的强弱，而这种极性与化合物结构有相当密切的关系。各种官能团的极性，按下列顺序递增。
-CH2-CH2-＜CH=CH-＜OCH3＜-COOR＜=C=O＜-CHO＜—SH＜-NH2＜-OH＜-COOH
各种溶剂的极性顺序各资料介绍略有出入，表（3-5）供参考。
为了选择最佳的展开溶剂，通常多采用两种或两种以上的混合溶液剂系统。这种溶剂由“基础溶剂”及“洗脱溶剂”二部分组成。基础溶液剂常用极性小的溶剂，如正已烷、石油醚、苯、四氯化碳、氯仿等；洗脱溶液剂多用极性强的溶液剂，如丙同、乙醇、甲醇、乙酸乙脂等。表（3-6）为几种常见的二元溶液剂系统，可以看出洗脱溶剂增加所引起的极性改变。图3-4是以四氯化碳为基础溶剂，乙酸乙酯为洗脱溶剂所组成的二元溶剂系统在按不同比例混合时，对四种有机硫代磷本酯类杀虫剂在薄层板上分离的hRf值的影响。
在用纤维素、硅藻土等进行分配薄层色谱分析时，溶剂的选择原则与纸色谱法相同。主要取决於被分离化合物在展开溶剂及静相中的溶解度比，即分配系数。
在用聚酰胺为吸附剂时，按在溶剂中形成氢键能力的强弱，排列溶剂顺序如下：
水＜乙醇＜甲醇＜丙同＜稀碱（氢氧化铵或氢氧化钠）＜甲酰胺＜二甲基甲酰胺
薄层色谱中展开溶剂的选择，可采用以下两种简单的预试法：
（一）微薄层法：用普通的显微镜戴玻片，涂上吸附剂，活化后在底边点样，并在染色缸中展开5厘米，取出吹干后显色。若混合物能分离为各个单独的色斑，则展开溶剂可用。
（二）微量圆环法：将样品溶液点在薄层板上，可同时点数点，每点间距2-3厘米。再用毛细管分别吸取待试展开溶剂，依次滴加在各样品原点中，干后显色。如某种溶剂将待分离混合物形成一个个分离明显的同心圆环，则为较合适的展开溶剂。
表3-6混合溶剂的极性顺序




洗


脱


能


力

        环已烷
苯
环已烷：乙酸乙酯（95+5）
苯：乙酸乙酯（95+5）
氯仿
环已烷：乙酸乙酯（85+15）
苯：乙酸乙酯（85+15）
氯仿：丙同（9+1）
苯：甲醇（95+5）
环已烷：乙酸乙酯（1+1）
苯：乙醇（9+1）
氯仿：丙同（85+15）
苯：乙酸乙酯（1+1）
环已烷：乙酸乙酯（1+4）
乙酸乙酯
乙酸乙酯：甲醇（99+1）
苯：丙同（1+1）
丙同
二甲基甲酰胺
二甲基甲砜

八，薄层色谱操作技术
1，        薄层板的的制备及性质
薄层板的制备是将吸附剂涂布在大小适当的戴板上，形成一定厚度的薄膜。制备一定规格的薄层板，是保证获得满意的分离效果及良好的Rf值重现性必不可少的条件。具体制备方法及有关问题分别讨论如下：
（一）载板：戴板应对各种展开溶剂、化学显色试剂以及温度都具有稳定性，同时又应有一定的机械强度以便重复使用。常用的戴板中，以玻璃最好，一般玻璃只要表面平整光滑，厚度在2—4厘米，允差±0.1—0.2毫米即可。戴板大小无绝对规定，由斯塔尔推荐的标准规格为20×20厘米、20×10厘米。作为一般简单的快速薄层分离，也可用显微镜戴玻片作戴板。至于制备薄层色谱，所用戴板可达20×100厘米。戴板应非常干净，才能保证良好的粘着效果。故玻板应先用肥皂水洗净，再在重铬酸洗液内浸泡，然后清洗干净，最后用蒸馏水淋洗，晾干后备用。玻璃板的缺点是不易保存。
其他材料的戴板中，最常用的为塑料板。塑料戴板制备薄层板操作复杂，因此多为成品薄层板出售。其优点为使用简便，缺点为高温下抗腐蚀性差。其他如不锈钢板也有应用。
（二）吸附剂糊的配制：在选择好适当的戴板后，应根据需要，制备一定粘度的吸附剂匀浆供制备薄层板用。常用各种吸附剂糊的调制方法如下：
（1）硅胶
1）加石膏粘合剂：取硅胶G20克，置于玻璃乳钵中，将40毫升蒸馏水分两次加入，第一次加入30—35毫升，充分研磨后，再加入剩余的水。迅速小心研磨，直至开始出现凝胶状，立即铺板。吸附剂的加水量和加水后的搅拌时间相当重要，是制备薄层板成败的关键。若加水量过多，则吸附剂不易胶化；过少则胶化过快造成涂布困难。搅拌时间无具体规定，一般在45—65秒左右，以吸附剂开始出现凝胶状态时为佳，此时粘度增大，光泽洁白；超过此时则凝胶固化，不易涂布。目前不同厂牌及批号的吸附剂加水量及搅拌时间都有所不同，可以根据具体情况选择最佳条件。（其他无机吸附剂如氧化铝G、硅藻土G的制备方法与硅胶G相似）
2）加淀粉粘合剂：一般是在吸附剂中加入约5%的淀粉及二倍量的水，在沸水浴上加热，不断搅拌至呈一定的粘稠度，进行铺板。
3）加羟甲基纤维素粘合剂：通常取硅胶55克或氧化铝60—80克，加1%羟甲基纤维素水溶液100毫升，调成糊状，进行铺板。
（2）纤维素粉
1）天然纤维素粉：配成15%的纤维素水悬浮液，在电磁搅拌器上混合30—60秒钟，纤维素粉不需加任何粘合剂，即可铺板。
2）微结晶纤维素粉：配制成15%—30%的水悬浮液，电磁搅拌器上充分混合1分钟，即可铺板。搅拌过久可能形成凝胶而失败。
3）乙酰化纤维素粉：根据纤维素乙酰化的程度不同，称取适量，加95%乙醇，充分搅拌后铺板。
（3）聚酰胺粉
取聚酰胺粉12克，加甲醇50毫升，用力充分振摇后铺板。若加入2。5克纤维素粉及40毫升甲醇，在电磁搅拌器上混合成浆，可制成坚固的薄层板。
（4）离子交换剂
1）离子交换树脂：取5克纤维素MN300加少量水搅拌几分钟，再加20—30毫升蒸馏水，继续搅拌，加30克Dowex50树脂，最后加25毫升水，铺板。
2）离子交换纤维素：用蒸馏水配制成10—20%离子交换纤维素，按一般吸附剂铺板法进行铺板，粘着效果良好。
（三）薄层板制备：薄层板的制备方法，目前常用的有浸渍法、倾注法、喷雾法及涂布法。其中最常用的方法为涂布法。各法简述如下：
（1）浸渍法：用于小型薄层板的制备，如戴玻片板。所用的吸附剂糊，最好用有机溶剂来配制，如氯仿-丙同或氯仿-甲醇混合液。将两张玻片背靠背地贴紧，放在吸附剂糊中浸渍，取出后放在水平板上，即可在玻片上形成薄层。
（2）倾注法：与浸渍法类似，操作简便，不需特殊仪器。将一定量的吸附剂糊，均匀地倾注在玻片上，再入置水平板上，使其形成厚度较为均匀的薄层。
（3）喷雾法：采用气体压力喷雾方法，将吸附剂糊均匀地喷洒在玻片上，形成一层薄层。
（4）涂布法：本法为实验室最常用的薄层板制备法。薄层涂布器由涂布台及涂布仪二者组成，有商品出售。也可以自制，基本结构如图4—1，材料可用不锈钢或有机玻璃。图4—2为一种自制的简易涂布器。这种涂布器有一个活动的闸板，涂布时吸附剂从闸板下的缝隙流出，涂在载板上。根据薄层厚度的要求不同，可制成多种规格缝隙的闸板，以便调换。一般有250、275、500、750、1000和2000微米等规格的闸板。商品涂布器种类较多，最常用的为斯塔尔型涂布器。涂布法制备薄层板易精确控制厚度，是其最大的优点。其他三种方法都具有不易控制薄层厚度的缺点。
（四）薄层板的活化与贮存：吸附薄层色谱的薄层板，首先应具有一定的吸附活性，才能达到良好的分离效果。薄层板的活度与吸附剂中水份含量有关，水份含量高，则活度减弱。因此，为达到某一规定的吸附活度，就应加温除去薄层中的水份。这一过程称为薄层板的活化，其操作为：将涂布后的薄层板在常温下放置15—20分钟，使水份蒸发、吸附剂凝固。这一过程中薄层板有如下现象：
（1）开始薄层板表面有闪亮光泽。
（2）几分钟后光泽消失。
（3）最后薄层凝固，颜色变白，水份蒸发约50%。
薄层板的活度级可用标准色素测定，其方法如下：
（1）硅胶薄层板的活度测定：称取标准色素奶油黄、苏丹红及靛酚蓝各40毫克，溶于100毫升苯中，将此混合溶液点于已活化的薄层板上，用正已烷或石油醚展开10厘米，所有色素均应停留在原点；而用苯展开10厘米时，则应分离成三个清晰的斑点。其Rf值应分别为：奶油黄0.58，苏丹红0.19，靛酚蓝0.08。而且展开溶剂前沿的上升速度应在30分钟移动10厘米。
（2）氧化铝板的活度测定：称取偶氮苯30毫克，对甲氧基偶氮苯、苏丹黄、苏丹红及对氨基偶苯各20毫克，分别溶于50毫升四氯化碳中，并各取10微升点于已活化的氧化铝板上，用四氯化碳为展开溶剂，根据标准色素的Rf值（下表），查出其活度级。
氧化铝板活度级拜克曼分类法
染料名称        Rf       值
        活动级Ⅱ        活动级Ⅲ        活动级Ⅳ        活动级Ⅴ
偶氮苯
对甲氧基偶氮苯
苏丹黄
苏丹红
对氨基偶氮苯        0．59
0．16
0．01
0．00
0．00        0．74
0．49
0．25
0．10
0．03        0．85
0．69
0．57
0．33
0．08        0．95
0．89
0．78
0．56
0．19
薄层板活化后，应立即使用，若特殊情况需要保存时，可在活化后，立即贮存于硫酸干燥器内，以免吸收空气中的水份及某些气体而影响活度。保存时间约一周，不宜过长。
（五）烧结薄层板的制备及性质：目前，硅胶和氧化铝薄层板应用较广，但这种薄层板还有不足之处。首先必须临时制备，较为麻烦，而且只能使用一次，吸附剂消耗量大，不够经济；其次这种薄层板非常脆弱，无论在使用或者保存上都不够方便。
（六）薄层板质量规格：根据以上各种方法制成的薄层板，其质量应符合下列要求。
（1）表观性状：应表面平整、光滑、无印痕和气泡，对光观察均匀。
（2）机械强度：薄层板在浸入展开溶剂内及喷洒显色剂等操作过程中，薄层不脱落，加热过程不裂缝。
（3）毛细管性能：展开过程中，溶剂前沿应呈一水平线，上升速度适当，250微米厚度的薄层板，用苯展开时，上升10厘米应在30—40分钟为佳。
（4）薄层厚度：薄层厚度应均匀一致，符合实验要求，分析用薄层板，一般为250—500微米，而制备用薄层板为500—2000微米。薄层厚度影响动相溶剂展开的速度［5］。以正已烷-乙酸乙酯（9+1）为展开溶剂，在一规定时间内在不同厚度的硅胶板上展开，结果各板展开的距离不等，见图4—5。从图中还可以看出在250微米厚度以内，薄层板愈薄，展开速度愈慢。
2，点样
薄层色谱中，点样与色斑的形成有一定关系。要求滴加的样品溶液原点应尽可能小，一般直径不超过3毫米为适宜。对于薄层定量测定，更应使各原点面积大小基本一致。点样的方法有以下两种；
（一）直接点样法：首先在薄层板上用硬质铅笔或解剖针，在距底边3厘米或2.5厘米处，轻轻描划出点样的起始线。并根据规定的展开距离（10厘米或12厘米）在薄层板上端画出展开溶剂前沿的到达线。然后用微量注射器或尖端磨细的血色素吸管，直接将样品溶液点加在起始线上，每点之间距离为1.5厘米。点样时可用空气流缓缓吹过点样原点，以便溶剂迅速挥发，原点面积不至过大。微量注射器最适用于薄层色谱的点样。但一般尖针头液滴不易落下，也易搓戳破薄层，故不适用。简单的改进方法可将针头磨平，但如不小心又会使针孔被吸附剂颗粒堵死。对于样品溶液只有10微升以内的点样，手工操作即可，但在10微升以上时，手工点样不可避免地会造成失误，同时也过于劳累、烦琐。故一般是将注射器固定在一个架子上操作。将针尖同薄层板的距离和滴液的速度控制恒定，因此原点大小也可以控制，而且又可以同时点几个样品，故其优点较多。
点样时应注意不使针尖将薄层板戳成小孔，以免形成非圆形的不规则色斑。因为如果原点有小孔，在展开时通过原点中心轴的溶剂，将比小孔周围的溶剂慢一些，这样Rf值较高的化合物色斑就呈三角形，而Rf值较低的化合物色斑就呈新月形。
若点样溶液体积过大，原点的面积也增大，会影响结果。这种情况，可选择一种能使所有待分离化合物的Rf值都等于1的展开溶剂，先作一短距离展开，此时待分离化合物将沿展开溶剂前沿，形成一个与底边平等行的细线，此线即可作样品的起始线，不过原点不是一个圆点，而是一根细线。对于制备薄层色谱，需要尽可能地增大制备量，点样量就需要增大，因此常采用线状点样，点样体积可达几百微升。
薄层点样应力求迅速，一般不超过10分钟。因为薄层板暴露的时间过长，会吸收空气中的水份而改变活度，影响分离效果。因此，点样时要求有纯熟的技术。
（二）滤纸移样法：直接点样法，很难使原点面积大小一致，也很难控制直径在3毫米以内，而且又容易损伤薄层的表面，特别是在薄层板上进行测量面积定量时，这些缺点会影响测定结果。滤纸移样法可以克服上述缺点，其操作方法为；
用内径为3毫米的皮带冲，将色谱滤纸冲成圆片，用细标本针挑起滤纸圆片，将样品溶液分次缓缓点在圆片上，每次点样后要待溶液完全挥发后再点第二次，如图4—10所示。加外在薄层板的起始线上，用皮带冲轻压薄层，使薄层形成3毫米的圆孔，孔内放一点糊状淀粉，将点好样的滤纸圆片，仔细放入孔内，使其粘附即可。
3，展开
薄层色谱法的展开方式与滤纸色谱法相似，基本类型可分为上行展开，下行展开及水平展开三种。下行展开法目前少有应用，本节不再介绍。
（一）上行展开法：本法为最常应用的一种方法，其展开仪器及方式有以下几种：
（1）不饱合展开槽：常用的为长方形标准缸，并附有可严密封口的玻璃盖。展开槽的大小以放下薄层板为宜，不宜过大。首先将展开溶剂倒入槽内，。一般展开高度为距原点10—12厘米，根据情况亦可上升至15厘米。
由于此法是在不饱合展开槽内，薄层板上的展开溶剂不断一由薄层板上挥发，而挥发的速度由薄层板的中间到两边逐渐增加，因此，溶剂上升的量两边大于中间。所以同一种化合物在同一张薄层板上，所得色斑的Rf值两边较高而中间略低。这一现象称为“边沿效应”。特别是用混合溶剂时，更易出现边沿效应。
（2）饱合展开槽：在展开槽的三面内壁围上滤纸，薄层板相对的一面不围滤纸，加入展开溶剂，使溶剂沿滤纸上升，当滤纸完全为溶剂润湿时，溶剂由滤纸表面挥发，槽内就为展开溶剂蒸气所饱和，此时放入薄层板进行展开。由于槽内充满溶剂蒸气，薄层板上的溶剂不再挥发，因此可以消除边沿效应。在饱合槽内展开，比在不饱合槽内展开快，Rf值的重现性也较好。
（二）水平展开法：常用的水平展开有两种方式。其一如图4—16，在一扁平玻璃槽内，一端放一卷有滤纸的玻棒，另一端放一不卷滤纸的玻棒，立即加盖，此时展开溶剂沿滤纸流向薄层板展开。此法目前已少有应用。另一种为环状薄层展开法，原点点在薄层板的中间，通过棉花的毛细作用，使溶剂上升到薄层以上，向四周呈环状展开
（三）楔形展开法：用不锈钢刀把薄层板表面刮成楔形，展开时，溶剂通过原点后，就呈放射状扩散，随展开溶剂的扩散，被分离的化合物形成弧状。这种展开技术分离容量大，适用于Rf值接近，分离较难点的混合物。
（四）双向展开法：纸色谱中常用的双向展开法，对于分离复杂的天然混合物是非常成功的，这种展开法也适用于薄层色谱。以双向展开中，通常用20×20厘米的标准规格的薄层板。将样品点在薄层板的一角，距两边各2厘米处，按一般上行法用溶剂I展开一次，取出薄层板，挥干溶剂，须时针方向转动90°，即在原来展开方向垂直的一边，用溶剂Ⅱ再展开一次。由于两种溶剂分离效能不同，被分离的混合物将分布在方形薄层板上。
（五）梯度展开法：柱色谱中的梯度淋洗法，也可应用在薄层色谱的展开中。这种展开方法是在展开过程中，不断改变混合溶剂中的百分比组成，从面增进分离效能，同时又可消除其它展开法出现的拖尾现象。（3）处以匀速加入另一溶剂Ⅱ，并经搅拌器（2）迅速混合，过多的溶剂由排液管（4）溢出。这种情况下，展开槽内溶剂的百分比组成，将是不断均匀地改变。
（六）分阶展开法：这种展开法，适用于分离含有极性差异比较大的化合物。具体方法是用两种不同极性的溶剂分两次展开，第一次展开距离较短，约5—6厘米，而第二次展开距离较长，约10—12厘米。在第一次展开时，若用强极性溶剂，则非极性化合物随溶剂移动在液体前沿，而极性化合物则在此展开中分离。第二次展开时用非极性溶剂展开，则非极性的化合物将在薄层板上部分离，极性化合物在第一次展开距离内维持不变。
（七）多级展开法：即将同一展开溶剂，在一张薄层板上多次展开，这种方法也是纸色谱中应用的一种方法。用来分离一次展开不易分离，而且Rf值较低的混合物。
4，显色
显色是薄层色谱法的一项重要步骤，在薄层展开后，通过显色技术，观察被分离化合物的Rf值有其分离状况，是薄层定性及定量工作的基础。常用的显色方法有以下几类：
（一）物理显色法：除了有色化合物（如色素等）在可见光照射下直接进行鉴定外，在薄层色谱的显色中，紫外光波是一种主要的检定光源，常用的有短波紫外线（波长254毫微米）及长波紫外线（波长365毫微米）两种。应用紫外线检定的方法可分为三类：
（1）使被分离的化合物在紫外线激发下，显示出荧光。这种方法主要是用来对那些能在紫外线激发下显示荧光的物质进行显色，方法是将展开后的薄层板直接在长波紫外线下照射，此时，被分离的化合物即在黑色背景下，显示出荧光斑点。用解剖针在斑点周围加上标记，即可进行观察。如黄曲霉毒素类化合物等的检定属于此类方法。
（2）使含有荧光物质的薄层板在紫外线激发下显出荧光。这种方法主要是对那些对短波紫外线有一定吸收能力的被分离的化合物进行显色。由于这类化合物对紫外线有吸收作用，而形成色斑部分荧光猝灭，斑点呈黑色，同时色斑以外部分则因紫外线的激发而显示出荧光，这种方法称为荧光猝灭法。［29］所用含荧光物质的薄层有硅胶GF254、氧化铝GF254硅藻土GF254等。
（3）促使被分离的化合物在紫外线照射下，与化学显色剂进行反应而产生色斑。如有机氯杀虫剂在喷洒硝酸银显色剂后，在短波紫外线照射下可产生黑色斑点。
（二）化学显色法；化学显色法是借助被分离的化合物，在薄层板上与化学显色试剂进行化学反应，从而产生有色化合物，显示出色斑的位置。化学显色的方法通常是用喷雾法，即将显色试剂喷洒在薄层板上，使之产生化学反应。目前，各实验室常用的喷雾仪器喷雾时，喷雾器距薄层板的距离要适当，压力大小要合适，使喷出的雾滴均匀分布在薄层板上。若距离薄层板太近、压力过大或液滴不均匀，均能破坏薄层板的板面，使试验失败。化学显色法是薄层显色中最常用的一种方法。
很多显色试剂具有毒性，某些还有强烈的腐蚀性，因此，喷雾操作应在毒气柜内进行，操作者应有防护措施，如防毒口罩、橡皮手套等。
（三）酶化学显色法：利用酶抑制技术，在薄层板上进行酶化学反应，从而显示出色斑。这种方法有两种类型。一种为被检定物质本身为酶化合物，如薄层分离淀粉酶，展开后可喷洒淀粉溶液，进行孵化后再喷洒碘溶液，可得蓝色背景上显白色的斑点。另一类为被分离的物质有抑制酶的作用，如有机磷酸酯类杀虫剂具有抑制胆碱酯酶的作用，因此在分离有机磷酸酯类化合物的薄层板上，喷洒含有胆碱酯酶的溶液及酶水解基质（可以被酶水解并产生有色物质的试剂），经37℃保温30分钟，进行酶水解作用，则在有机磷化合物斑点处，酶受抑制而无色，背景显一定的颜色。
（四）生物显色法：在抗菌素的薄层色谱分离中，利用抗菌素对微生物的抑制作用，进行显谱鉴定。
九，Rf值及其影响因素
Rf值（比移值）是薄层色谱定性的重要依据。在特定的色谱条件下，被分离化合物的Rf值与该物质的特性有关，亦即化合物的Rf值为该物质的一种物理常数。Rf值作为定性的基础，首先必须注明色谱条件，否则Rf值将失去作为定性基础的意义。色谱条件主要有吸附剂、展开溶剂及展开方式等。薄层色谱中影响Rf值的因素很多，造成Rf值重现性较差，误差可达±0.05或更大。因此依据色谱手册中Rf值直接定性，准确性往往较差，故在实际工作中多采用标准对照法。这种方法是在同一张薄层板上，同时分别点加样品溶液及待测化合物的标准溶液。展开后若待测化合物的Rf值与标准物质的Rf值相同，即可认为待测化合物与标准物质相同。由于这种方法是在同一张薄层板上进行色谱分离，其条件相同，故结果准确可靠。当然，最好是用两种展开溶剂系统，在两张薄层板上分别用标准对照法展开，以免造成偶然误差。
由于Rf值的重现性不易控制，有人提出了Rs值法，这一方法为：在薄层板上除点加样品溶液之外，再点加一种标准色素，如奶油黄、苏丹红、橙黄G等，或者点加被分离化合物的同系物，展开后两者移行距离之比，即为Rs值.
虽然Rf值是薄层色谱法定性的重要依据，但影响Rf值的因素很多，因此为获得比较好的Rf值的重现性，应注意以下各种因素：
（一）薄层的厚度：实验证实，薄层的厚度对溶剂的展开速度有一定影响。以正已烷-乙酸乙酯（99+1）为溶剂，在几个不同厚度的硅胶板上展开，结果在规定的时间内各板的展开距离不一样；厚度在250微米以内，薄层的厚度越薄，则展开速度越慢。因此厚度将影响薄层色谱的Rf值。
至于厚度在250微米以上时，薄层厚度对Rf值的影响与所使用的展开槽的类型有关。综上所述，可以认为薄层厚度在250—500微米之间，采用充分饱和的展开槽，厚度对Rf值的影响是不大的。
（二）展开方式：第四章第三节中已叙述了薄层色谱的展开方式，其中主要有不饱和展开、饱和展开及夹层式展开三种，Rf值随展开方式不同而异。总的情况是饱和展开的Rf值较不饱和为低，这是由于在饱和展开槽内，溶剂从薄层板上挥发很少，减少了溶剂在薄层板上流动的溶量，加快了展开速度。另一方面不饱和展开槽内，薄层板上溶剂大量挥发，溶剂耗用量增大，因而Rf值较高。在饱和展开槽内薄层板在槽内进行溶剂蒸气平衡过程中，吸附剂吸附了一定量的溶剂，而同时逐去了少量水份，使薄层板活度有所增加，也造至Rf值的下降。不饱和展开槽往往形成“边沿效应”，影响Rf值，这一点已在前一章述及。但是捷伍（Zeeuw）提出，不饱和展开槽分离效能较饱和槽的分离效能好，并且认为在严格控制展开条件下，也可以获得良好的Rf值重现性。他用巴比土的同系物进行了一系列实验，证实不饱和展开槽的上述优点。
（三）相对湿度：展开槽内的相对湿度，对Rf值的影响，也有一些文献报道，因此，在薄层色谱操作中，特别要注意大气相对湿度的影响，若在湿度较高的环境中操作，则点样应特别迅速，尽量不要使薄层板在空气中暴露时间过久，以免空气中的水份改变薄层板的活度，引起Rf值的变动。
（四）温度：在薄层色谱操作中温度对Rf值的影响，一般情况下是不严重的
(五) 展开溶剂：展开溶剂的组成应该是固定的，因此在配制时其比例应非常准确，否则将影响Rf值的重现性。展开溶剂的纯度要特别注意，如丙同中水份的含量对Rf值有一定的影响，因为水份含量改变将影响展开溶剂的极性。一般溶剂采用分析纯试剂即可，必要时可精制后使用。
(六) 薄层板的活度：活度对Rf值有影响是肯定的，因此要严格控制活化的温度与时间。活化后的薄层板，不宜在空气中暴露，亦不宜在干燥器内放置过久。
除以上所述影响Rf值的因素外，其他如吸附剂的粘度，粘合剂的种类，点样量等均对薄层色谱的Rf值有些影响，应加以注意。
十，薄层色谱定量
长期以来，薄层色谱在含量测定方面，被认为是一种半定量的技术方法，因为与其他微量定量技术比较，还存在不足之处。但是，近年来由于仪器与技术不断发展，薄层定量已达到了一定的水平。薄层色谱的定量方法可以分为两种类型，其一系将被分离化合物从薄层板上洗脱，然后用其他方法测定，其二是在薄层板上直接测定，如面积法、扫描光密度法等。
（1）        洗脱法
此法是将展开后被分离化合物斑点区的吸附剂，从薄层板上剥离下来，再用适当的溶剂溶解，提取出被分离的化合物，然后用其他的含量测定方法进行测定。常用的测定方法有分光光度法，其他如极谱法、库伦滴定法、气相色谱法等也有应用。严格说来，薄层色谱在这里仅仅的起着分离的作用，而含量测定是依靠其他分析技术，所以在这一方法中，主要是被分离化合物的洗脱技术。首先需要确定色斑的位置，常用的方法之一为紫外光显色法，可用萤光法或萤光猝灭法，显色后用解剖针标记出色斑位置，然后取下洗脱。萤光法虽然简单方便，但有时紫外线可能促使被分离的化合物分解，使结果偏低，因此采用标准物质对照法更为可靠。也就是在被分离化合物的薄层板上同时点上标准物质，展开后使标准物质显色，而待测物质不显色，然后在与标准斑点相平行的位置处，确定被分离化合物的斑点位置，取下洗脱。常用的从薄层板上分离斑点及洗脱技术是：取滴管一支，加入玻棉，尖端连接抽气泵，另一端置薄层板样品斑点位置上，用解剖针细心拨动吸附剂，尽量使其完全吸入滴管，然后取下滴管，用适当的溶剂、溶解提取，提取液收集于离心管内备用。这一方法往往由于玻棉过滤不能除去吸附剂的细微颗粒，使样品溶液产生乳光或混浊，在使用光度法测定时将造成一定的误差。故采用滤膜过滤或离心沉淀的方法，效果就会比玻棉好。
洗脱法仍存在以下几个缺点：
（一）当化合物被吸附剂强烈吸附时，定量回收往往不够满意；
（二）吸附剂上杂质有可能引起干扰；
（三）操作烦琐
（2）        面积法
  面积法是在薄层板上直接定量的一种方法。与洗脱法比较，简化烦琐的洗脱操作，根据薄层板上斑点面积与物质浓度的关系，直接进行含量测定，具有一定的优越性。一种最简单的方法是目视比较法，在同一张薄层板上，分别点加待测样品溶液及一系列不同含量的标准物质溶液，进行展开，显色后，将样品斑点面积与标准斑点面积进行比较，估量待测化合物的含量。这种方法用在纸色谱上能得到较为准确的结果，但在薄层色谱上应用，误差较大，目前少有采用。
十一，样品的提取与净化
在食品卫生分析中，待测定的成分往往以极端量存在于样品中，而这些样品的组成又是非常复杂的，因此，在进行薄层色谱分析之前，首先需要经过一个对待测成分的提取、净化及浓缩的处理过程，才便于点样分析。这一过程不仅可以消除测定中的干扰，同时又可提高测定的灵敏度。如100克样品，经提取、净化后再浓缩至1毫升，这样就可提高灵敏度100倍。因此对于食品的薄层色谱分析，样品的提取与净化是非常重要的一环。
（一），样品的提取
样品的提取，就是用一种溶剂，将待测成分从样品中提取至提取溶剂内，而大部分非测定成分又不被提取。提取的方法取决于样品及待测成分的性质。如固体样品多用浸渍法、索氏提取法、洗脱法，液体样品则多用液-液萃取的方法。提取溶剂的选择，要根据待测成分的极性强弱以及在提取溶剂中的溶解度待性质而定。比如在测定食品中农药的残留时，多用各种有机溶剂。对于极性较弱的农药，如有机氯、对硫磷、马拉硫磷等，就用非极性溶剂，如已烷，石油醚等提取；对于极性强的农药，如乐果、敌百虫等有机磷杀虫剂，就用一定极性的二氯甲烷、三氯甲烷或乙酸乙酯待溶剂提取。常用的提取方法有以下几类：
1 浸渍法：将充分粉碎后的干样品，置磨口三角瓶内，加入选定的提取溶剂，塞上瓶塞，置振荡器上振摇提取一定时间，然后过滤或离心分出溶剂。对于含有一定水分的样品，如肉食品、水果、蔬菜等，可在样品中加入一定数量的无水硫酸钠，在研钵中充分研细，再转至磨口三角瓶内提取。这类样品也可以在组织捣碎机内与提取溶剂混合，以20000转/分的高速充分切碎，增加提取溶剂和样品的接触面积，就可在较短时间内将待测成分从样品中提出。组织捣碎机混合浸渍的方法较直接振摇法的提取效率高。但往往出现乳化现象，必须用高速离心机分离提取溶剂。
2 索氏提取法：此法是用索氏提取器，以少量的溶剂反复提取样品中的待测成分。当提取溶剂受热后，溶剂不断蒸发，并在提取器冷凝管壁上凝结成液体，滴入样品管中，进行提取。样品管中溶剂达到一定高度时，因虹吸作用，又自动流入提取瓶内，如此反复多次提取。此法的优点是不断地用新鲜溶剂浸渍样品，提取较完全，操作也简单，特别是在提取后可以在本仪器内直接浓缩而得到的浓缩液。缺点是提取时间长，一般4—10小时或更长。
3 洗脱法：将研碎的样品与去活化的硅胶（在600℃以上灼烧数小时）或弗罗里土拌合，装入色谱管，用选定的洗脱溶剂流经色谱柱，进行洗脱，脂肪、色素及不溶性的杂质等被硅胶或弗罗里土吸附或阻留，待测成分则随溶剂被洗脱。其优点是避免了浸渍法中出现的乳化现象。
4 萃取法：对液体样品的提取，上述各法均不适用。因此，采用液-液萃取的方法。提取溶剂的选择，可根据被提取成分在有机溶剂相及水相中的分配系数而定。
二，提取液的净化

样品提取液中常含有各种非测定成分，如脂肪、蛋白质、色素、腊质等，在进行薄层色谱分析时，会受到这些物质的干扰。因此，将样品提取液经过适当的处理，除去干扰物质，而又不使待测成分遭到损失，称为净化。净化的方法随样品性质不同而异。在不同样品的薄层层析分析中。有不同的样品提取液的净化方法，在分析方法中都有相应的规定，这里不再赘述。
第三节 质谱分析

质谱分析法是一种物理分析方法，它是通过将样品转化为运动的气态离子，按质荷比(M/Z)大小进行分离并记录其信息的分析方法。所得结果以图谱表达，即所谓的质谱图（亦称质谱，Mass Spectrum）。根据质谱图提供的信息可以进行多种有机物及无机物的定性和定量分析、复杂化合物的结构分析、样品中各种同位素比的测定及固体表面的结构和组成分析等。
质谱法是将被测物质离子化，按离子的质荷比分离，测量各种离子谱峰的强度而实现分析目的的一种分析方法。质量是物质的固有特征之一，不同的物质有不同的质量谱——质谱，利用这一性质，可以进行定性分析（包括分子质量和相关结构信息）；谱峰强度也与它代表的化合物含量有关，可以用于定量分析。质谱仪一般由四部分组成：进样系统——按电离方式的需要，将样品送入离子源的适当部位；离子源——用来使样品分子电离生成离子，并使生成的离子会聚成有一定能量和几何形状的离子束；质量分析器——利用电磁场（包括磁场、磁场和电场的组合、高频电场、和高频脉冲电场等）的作用将来自离子源的离子束中不同质荷比的离子按空间位置，时间先后或运动轨道稳定与否等形式进行分离；检测器——用来接受、检测和记录被分离后的离子信号。一般情况下，进样系统将待测物在不破坏系统真空的情况下导入离子源（10-6～10-8mmHg），离子化后由质量分析器分离再检测；计算机系统对仪器进行控制、采集和处理数据，并可将质谱图与数据库中的谱图进行比较。
一、 进样系统和接**术将样品导入质谱仪可分为直接进样和通过接口两种方式实现。
1. 直接进样在室温和常压下，气态或液态样品可通过一个可调喷口装置以中性流的形式导入离子源。吸附在固体上或溶解在液体中的挥发性物质可通过顶空分析器进行富集，利用吸附柱捕集，再采用程序升温的方式使之解吸，经毛细管导入质谱仪。对于固体样品，常用进样杆直接导入。将样品置于进样杆顶部的小坩埚中，通过在离子源附近的真空环境中加热的方式导入样品，或者可通过在离子化室中将样品从一可迅速加热的金属丝上解吸或者使用激光辅助解吸的方式进行。这种方法可与电子轰击电离、化学电离以及场电离结合，适用于热稳定性差或者难挥发物的分析。目前质谱进样系统发展较快的是多种液相色谱/质谱联用的接**术，用以将色谱流出物导入质谱，经离子化后供质谱分析。主要技术包括各种喷雾技术（电喷雾，热喷雾和离子喷雾）；传送装置（粒子束）和粒子诱导解吸（快原子轰击）等。
2. 电喷雾接口带有样品的色谱流动相通过一个带有数千伏高压的针尖喷口喷出，生成带电液滴，经干燥气除去溶剂后，带电离子通过毛细管或者小孔直接进入质量分析器。传统的电喷雾接口只适用于流动相流速为1～5μl/min的体系，因此电喷雾接口主要适用于微柱液相色谱。同时由于离子可以带多电荷，使得高分子物质的质荷比落入大多数四极杆或磁质量分析器的分析范围（质荷比小于4000），从而可分析分子量高达几十万道尔顿（Da）的物质。
3. 热喷雾接口存在于挥发性缓冲液流动相（如乙酸铵溶液）中的待测物，由细径管导入离子源，同时加热，溶剂在细径管中除去，待测物进入气相。其中性分子可以通过与气相中的缓冲液离子（如NH4+）反应，以化学电离的方式离子化，再被导入质量分析器。热喷雾接口适用的液体流量可达2ml/min，并适合于含有大量水的流动相，可用于测定各种极性化合物。由于在溶剂挥发时需要利用较高温度加热，因此待测物有可能受热分解。
4. 离子喷雾接口在电喷雾接口基础上，利用气体辅助进行喷雾，可提高流动相流速达到1ml/min。电喷雾和离子喷雾技术中使用的流动相体系含有的缓冲液必须是挥发性的。
5. 粒子束接口将色谱流出物转化为气溶胶，于脱溶剂室脱去溶剂，得到的中性待测物分子导入离子源，使用电子轰击或者化学电离的方式将其离子化，获得的质谱为经典的电子轰击电离或者化学电离质谱图，其中前者含有丰富的样品分子结构信息。但粒子束接口对样品的极性，热稳定性和分子质量有一定限制，最适用于分子量在1000Da以下的有机小分子测定。
6. 解吸附技术将微柱液相色谱与粒子诱导解吸技术（快原子轰击，液相二次粒子质谱）结合，一般使用的流速在1～10μl/min之间，流动相须加入微量难挥发液体（如甘油）。混合液体通过一根毛细管流到置于离子源中的金属靶上，经溶剂挥发后形成的液膜被高能原子或者离子轰击而离子化。得到的质谱图与快原子轰击或者液相二次离子质谱的质谱图类似，但是本底却**降低。
二、 离子源离子源的性能决定了离子化效率，很大程度上决定了质谱仪的灵敏度。常见的离子化方式有两种：一种是样品在离子源中以气体的形式被离子化，另一种为从固体表面或溶液中溅射出带电离子。在很多情况下进样和离子化同时进行。
1. 电子轰击电离（EI）气化后的样品分子进入离子化室后，受到由钨或铼灯丝发射并加速的电子流的轰击产生正离子。离子化室压力保持在10-4～10-6 mmHg。轰击电子的能量大于样品分子的电离能，使样品分子电离或碎裂。电子轰击质谱能提供有机化合物最丰富的结构信息，有较好的重现性，其裂解规律的研究也最为完善，已经建立了数万种有机化合物的标准谱图库可供检索。其缺点在于不适用于难挥发和热稳定性差的样品。
2. 化学电离（CI）引入一定压力的反应气进入离子化室，反应气在具有一定能量的电子流的作用下电离或者裂解。生成的离子和反应气分子进一步反应或与样品分子发生离子?分子反应，通过质子交换使样品分子电离。常用的反应气有甲烷，异丁烷和氨气。化学电离通常得到准分子离子，如果样品分子的质子亲和势大于反应气的质子亲和势，则生成［M+H］+，反之则生成［M-H］+。根据反应气压力不同，化学电离源分为大气压、中气压（0.1～10mmHg）和低气压（10-6mmHg）三种。大气压化学电离源适合于色谱和质谱联用，检测灵敏度较一般的化学电离源要高2～3个数量级，低气压化学电离源可以在较低的温度下分析难挥发的样品，并能使用难挥发的反应试剂，但是只能用于傅里叶变换质谱仪。
3. 快原子轰击（FAB）将样品分散于基质（常用甘油等高沸点溶剂）制成溶液，涂布于金属靶上送入FAB离子源中。将经强电场加速后的惰性气体中性原子束（如氙）对准靶上样品轰击。基质中存在的缔合离子及经快原子轰击产生的样品离子一起被溅射进入气相，并在电场作用下进入质量分析器。如用惰性气体离子束（如铯或氩）来取代中性原子束进行轰击，所得质谱称为液相二次离子质谱（LSIMS）。此法优点在于离子化能力强，可用于强极性、挥发性低、热稳定性差和相对分子质量大的样品及EI和CI难于得到有意义的质谱的样品。FAB比EI容易得到比较强的分子离子或准分子离子；不同于CI的一个优势在于其所得质谱有较多的碎片离子峰信息，有助于结构解析。缺点是对非极性样品灵敏度下降，而且基质在低质量数区（400以下）产生较多干扰峰。FAB是一种表面分析技术，需注意优化表面状况的样品处理过程。样品分子与碱金属离子加合，如［M+Na］和［M+K］，有助于形成离子。这种现象有助于生物分子的离子化。因此，使用氯化钠溶液对样品表面进行处理有助于提高加合离子的产率。在分析过程中加热样品也有助于提高产率。在FAB离子化过程中，可同时生成正负离子，这两种离子都可以用质谱进行分析。样品分子如带有强电子捕获结构，特别是带有卤原子，可以产生大量的负离子。负离子质谱已成功用于农药残留物的分析。
4. 场电离（field ionization，FI）和场解吸（field desorption，FD）FI离子源由距离很近的阳极和阴极组成，两极间加上高电压后，阳极附近产生高达10+7～10+8V/cm的强电场。接近阳极的气态样品分子产生电离形成正分子离子，然后加速进入质量分析器。对于液体样品（固体样品先溶于溶剂）可用FD来实现离子化。将金属丝浸入样品液，待溶剂挥发后把金属丝作为发射体送入离子源，通过弱电流提供样品解吸附所需能量，样品分子即向高场强的发射区扩散并实现离子化。FD适用于难气化，热稳定性差的化合物。FI和FD均易得到分子离子峰。
5. 大气压电离源（API）API是液相色谱/质谱联用仪最常用的离子化方式。常见的大气压电离源有三种：大气压电喷雾（APESI），大气压化学电离（APCI）和大气压光电离（APPI）。电喷雾离子化是从去除溶剂后的带电液滴形成离子的过程，适用于容易在溶液中形成离子的样品或极性化合物。因具有多电荷能力，所以其分析的分子量范围很大，既可用于小分子分析，又可用于多肽、蛋白质和寡聚核苷酸分析。APCI是在大气压下利用电晕放电来使气相样品和流动相电离的一种离子化技术，要求样品有一定的挥发性，适用于非极性或低、中等极性的化合物。由于极少形成多电荷离子，分析的分子量范围受到质量分析器质量范围的限制。APPI是用紫外灯取代APCI的电晕放电，利用光化作用将气相中的样品电离的离子化技术，适用于非极性化合物。由于大气压电离源是独立于高真空状态的质量分析器之外的，故不同大气压电离源之间的切换非常方便。
6. 基质辅助激光解吸离子化（MALDI）将溶于适当基质中的样品涂布于金属靶上，用高强度的紫外或红外脉冲激光照射可实现样品的离子化。此方式主要用于可达100000Da质量的大分子分析，仅限于作为飞行时间分析器的离子源使用。
7. 电感耦合等离子体离子化（ICP）等离子体是由自由电子、离子和中性原子或分子组成，总体上成电中性的气体，其内部温度高达几千至一万度。样品由载气携带从等离子体焰炬中央穿过，迅速被蒸发电离并通过离子引出接口导入到质量分析器。样品在极高温度下完全蒸发和解离，电离的百分比高，因此几乎对所有元素均有较高的检测灵敏度。由于该条件下化合物分子结构已经被破坏，所以ICP仅适用于元素分析。
三、 质量分析器质量分析器将带电离子根据其质荷比加以分离，用于纪录各种离子的质量数和丰度。质量分析器的两个主要技术参数是所能测定的质荷比的范围（质量范围）和分辨率。
1. 扇形磁分析器离子源中生成的离子通过扇形磁场和狭缝聚焦形成离子束。离子离开离子源后，进入垂直于其前进方向的磁场。不同质荷比的离子在磁场的作用下，前进方向产生不同的偏转，从而使离子束发散。由于不同质荷比的离子在扇形磁场中有其特有的运动曲率半径，通过改变磁场强度，检测依次通过狭缝出口的离子，从而实现离子的空间分离，形成质谱。
2. 四极杆分析器<br>因其由四根平行的棒状电极组成而得名。离子束在与棒状电极平行的轴上聚焦，一个直流固定电压（DC）和一个射频电压（RF）作用在棒状电极上，两对电极之间的电位相反。对于给定的直流和射频电压，特定质荷比的离子在轴向稳定运动，其他质荷比的离子则与电极碰撞湮灭。将DC和RF以固定的斜率变化，可以实现质谱扫描功能。四极杆分析器对选择离子分析具有较高的灵敏度。
3. 离子阱分析器由两个端盖电极和位于它们之间的类似四极杆的环电极构成。端盖电极施加直流电压或接地，环电极施加射频电压（RF），通过施加适当电压就可以形成一个势能阱（离子阱）。根据RF电压的大小，离子阱就可捕获某一质量范围的离子。离子阱可以储存离子，待离子累积到一定数量后，升高环电极上的RF电压，离子按质量从高到低的次序依次离开离子阱，被电子倍增监测器检测。目前离子阱分析器已发展到可以分析质荷比高达数千的离子。离子阱在全扫描模式下仍然具有较高灵敏度，而且单个离子阱通过时间序列的设定就可以实现多级质谱（MSn）的功能。
4. 飞行时间分析器具有相同动能，不同质量的离子，因其飞行速度不同而分离。如果固定离子飞行距离，则不同质量离子的飞行时间不同，质量小的离子飞行时间短而首先到达检测器。各种离子的飞行时间与质荷比的平方根成正比。离子以离散包的形式引入质谱仪，这样可以统一飞行的起点，依次测量飞行时间。离子包通过一个脉冲或者一个栅系统连续产生，但只在一特定的时间引入飞行管。新发展的飞行时间分析器具有大的质量分析范围和较高的质量分辨率，尤其适合蛋白等生物大分子分析。
5. 傅里叶变换分析器<br>在一定强度的磁场中，离子做圆周运动，离子运行轨道受共振变换电场限制。当变换电场频率和回旋频率相同时，离子稳定加速，运动轨道半径越来越大，动能也越来越大。当电场消失时，沿轨道飞行的离子在电极上产生交变电流。对信号频率进行分析可得出离子质量。将时间与相应的频率谱利用计算机经过傅里叶变换形成质谱。其优点为分辨率很高，质荷比可以精确到千分之一道尔顿。
四、 串联质谱及联用技术1. 串联质谱两个或更多的质谱连接在一起，称为串联质谱。最简单的串联质谱（MS/MS）由两个质谱串联而成，其中第一个质量分析器（MS1）将离子预分离或加能量修饰，由第二级质量分析器（MS2）分析结果。最常见的串联质谱为三级四极杆串联质谱。第一级和第三级四极杆分析器分别为MS1和MS2，第二级四极杆分析器所起作用是将从MS1得到的各个峰进行轰击，实现母离子碎裂后进入MS2再行分析。现在出现了多种质量分析器组成的串联质谱，如四极杆-飞行时间串联质谱（Q-TOF）和飞行时间－飞行时间（TOF-TOF）串联质谱等，**扩展了应用范围。
离子阱和傅里叶变换分析器可在不同时间顺序实现时间序列多级质谱扫描功能。MS/MS最基本的功能包括能说明MS1中的母离子和MS2中的子离子间的联系。根据MS1和MS2的扫描模式，如子离子扫描、母离子扫描和中性碎片丢失扫描，可以查明不同质量数离子间的关系。母离子的碎裂可以通过以下方式实现：碰撞诱导解离，表面诱导解离和激光诱导解离。不用激发即可解离则称为亚稳态分解。MS/MS在混合物分析中有很多优势。在质谱与气相色谱或液相色谱联用时，即使色谱未能将物质完全分离，也可以进行鉴定。MS/MS可从样品中选择母离子进行分析，而不受其他物质干扰。MS/MS在药物领域有很多应用。子离子扫描可获得药物主要成分，杂质和其他物质的母离子的定性信息，有助于未知物的鉴别，也可用于肽和蛋白质氨基酸序列的鉴别。在药物代谢动力学研究中，对生物复杂基质中低浓度样品进行定量分析，可用多反应监测模式（multiple reaction monitoring，MRM）消除干扰。如分析药物中某特定离子，而来自基质中其他化合物的信号可能会掩盖检测信号，用MS1/MS2对特定离子的碎片进行选择监测可以消除干扰。MRM也可同时定量分析多个化合物。在药物代谢研究中，为发现与代谢前物质具有相同结构特征的分子，使用中性碎片丢失扫描能找到所有丢失同种功能团的离子，如羧酸丢失中性二氧化碳。如果丢失的碎片是离子形式，则母离子扫描能找到所有丢失这种碎片的离子。2. 联用技术色谱可作为质谱的样品导入装置，并对样品进行初步分离纯化，因此色谱/质谱联用技术可对复杂体系进行分离分析。因为色谱可得到化合物的保留时间，质谱可给出化合物的分子量和结构信息，故对复杂体系或混合物中化合物的鉴别和测定非常有效。在这些联用技术中，芯片/质谱联用（Chip/MS）显示了良好前景，但目前尚不成熟，而气相色谱／质谱联用和液相色谱／质谱联用等已经广泛用于药物分析。
（1） 气相色谱/质谱联用（GC/MS）气相色谱的流出物已经是气相状态，可直接导入质谱。由于气相色谱与质谱的工作压力相差几个数量级，开始联用时在它们之间使用了各种气体分离器以解决工作压力的差异。随着毛细管气相色谱的应用和高速真空泵的使用，现在气相色谱流出物已可直接导入质谱。
（2） 液相色谱／质谱联用（HPLC/MS）<br>液相色谱/质谱联用的接口前已论及，主要用于分析GC/MS不能分析，或热稳定性差，强极性和高分子量的物质，如生物样品（药物与其代谢产物）和生物大分子（肽、蛋白、核酸和多糖）。
（3） 毛细管电泳/质谱联用（CE/MS）和芯片/质谱联用（Chip/MS）毛细管电泳（CE）适用于分离分析极微量样品（nl体积）和特定用途（如手性对映体分离等）。CE流出物可直接导入质谱，或加入辅助流动相以达到和质谱仪相匹配。微流控芯片技术是近年来发展迅速，可实现分离、过滤、衍生等多种实验室技术于一块芯片上的微型化技术，具有高通量、微型化等优点，目前也已实现芯片和质谱联用，但尚未商品化。
（4） 超临界流体色谱/质谱联用（SFC/MS）常用超临界流体二氧化碳作流动相的SFC适用于小极性和中等极性物质的分离分析，通过色谱柱和离子源之间的分离器可实现SFC和MS联用。
（5） 等离子体发射光谱/质谱联用（ICP/MS）由ICP作为离子源和MS实现联用，主要用于元素分析和元素形态分析。
五、 数据处理和应用检测器通常为光电倍增器或电子倍增器，所采集的信号经放大并转化为数字信号，计算机进行处理后得到质谱图。质谱离子的多少用丰度表示（abundance）表示，即具有某质荷比离子的数量。由于某个具体离子的“数量”无法测定，故一般用相对丰度表示其强度，即最强的峰叫基峰（base peak），其他离子的丰度用相对于基峰的百分数表示。在质谱仪测定的质量范围内，由离子的质荷比和其相对丰度构成质谱图。在LC/MS和GC/MS中，常用各分析物质的色谱保留时间和由质谱得到其离子的相对强度组成色谱总离子流图。也可确定某固定的质荷比，对整个色谱流出物进行选择离子检测（selected ion monitoring， SIM），得到选择离子流图。质谱仪分离离子的能力称为分辨率，通常定义为高度相同的相邻两峰，当两峰的峰谷高度为峰高的10%时，两峰质量的平均值与它们的质量差的比值。对于低、中、高分辨率的质谱，分别是指其分辨率在100～2000、2000～10000和10000以上。质谱在药物领域的主要应用为药物的定性鉴别、定量分析和结构解析。如果一个中性分子丢失或得到一个电子，则分子离子的质荷比与该分子质量数相同。使用高分辨率质谱可得到离子的精确质量数，然后计算出该化合物的分子式，或者用参照物作峰匹配可以确证分子量和分子式。分子离子的各种化学键发生断裂后形成碎片离子，由此可推断其裂解方式，得到相应的结构信息。质谱用于定量分析，其选择性、精度和准确度较高。化合物通过直接进样或利用气相色谱和液相色谱分离纯化后再导入质谱。质谱定量分析用外标法或内标法，后者精度高于前者。定量分析中的内标可选用类似结构物质或同位素物质。前者成本低，但精度和准确度以使用同位素物质为高。使用同位素物质为内标时，要求在进样、分离和离子化过程中不会丢失同位素物质。在使用FAB质谱和LC/MS（热喷雾和电喷雾）进行定量分析时，一般都需要用稳定的同位素内标。分析物和内标离子的相对丰度采用选择离子监测（只监测分析物和内标的特定离子）的方式测定。选择离子监测相对全范围扫描而言，由于离子流积分时间长而增加了选择性和灵敏度。利用分析物和内标的色谱峰面积或峰高比得出校正曲线，然后计算样品中分析物的色谱峰面积或它的量。
EI: Electron Impact　电子轰击

    质谱法具有分析速度快、灵敏度高、提供的信息直接与其结构相关的特点。与气相色谱法联用，已成为一种最有力的快速鉴定复杂混合物组成的可靠分析工具得到了广泛应用。
    试样经离子化后形成质谱的分析方法。当气体（或能转化为气体的物质）分子在低压下受电子的轰击，产生各种带正电荷的离子，再通过稳定磁场使阳离子按照质量大小的顺序分离开来，形成有规则的质谱，然后用检测器进行检测，即可作定性分析和定量分析。
1、        分析经验
（1）在正离子模式下，样品主要以[M+H]+、[M+Na]+、[M+K]+准分子离子被检测；在负离子模式下，样品则大多以[M－H]－、[M+Cl]－准分子离子被检测。
（2）正离子模式下，样品还会出现M-1(M-H), M-15(M-CH3), M-18(M-H2O), M-20(M-HF), M-31(M-OCH3)等的峰。分子离子峰应具有合理的质量丢失.也即在比分子离子质量差在4-13，21-26，37-，50-53，65，66 是不可能的也是不合理的，否则，所判断的质量数最大的峰就不是分子离子峰，.因为一个有机化合物分子不可能失去4～13个氢而不断键.如果断键,失去的最小碎片应为CH3,它的质量是15个质量单位.
（3）分子离子峰应为奇电子离子，它的质量数应符合氮规则：在有机化合物中，凡含有偶数氮原子或不含氮原子的，相对分子质量一定为偶数，反之，凡今吸奇数氮原子的，相对分子质量一定是奇数，这就是氮规则。运用氮规则将有利于分子离子峰的判断和分子式的推定，经元素分析确定某化合物的元素组成后，若最高质量的离子的质量与氮规则不符，则该离子一定不是分子离子。
如果某离子峰完全符合上述3项判断原则，那么这个离子峰可能是分子离子峰;如果3项原则中有一项不符合，这个离子峰就肯定不是分子离子峰.应该特别注意的是,有些化合物容易出现M-1峰或M+1峰。
下面是常见有机化合物的质谱：





M-15        (.CH3)        M-27        (CHNH2.CHCH2)        M-32        (CH3OH,S,O2)
M-16        (O)        M-28        (CO,CH2CH2)        M-33        (CH3+H2O)
M-17        (.OH,NH3)        M-29        (CHO,C2H5)        M-34        (H2S)
M-18        (H2O)        M-30        (CH2O,NO)        M-35        (Cl)
M-26        (CN,HCCH)        M-31        (OCH3,CH2OH)        M-36        (2H2O,HCl)


2、基本原理
2.1 质谱分析的基本原理
使待测的样品分子汽化，用具有一定能量的电子束轰击气态分子，使其失去一个电子而成为带正电的分子离子，分子离子还可能断裂成各种碎片离子，所有的正离子在电场和磁场的综合作用下按质荷比（ ）大小依次排列而得到谱图。
因多数离子只带一个正电荷，z＝1，质荷比就是离子的质量。谱图给出了各种碎片的质量，把这些碎片再拼接起来，可得到原来的结构。
质谱仪是利用电磁学原理，使气体分子产生带正电运动离子，并按质荷比将它们在电磁场中分离的装置。 以线型单聚焦质谱仪为例说明质谱分析法的基本原理，其仪器结构如图2－1所示。试样从进样器进入离子源，在离子源中产生正离子。正离子加速进入质量分析器，质量分析器将其按质荷比大小不同进行分离。分离后的离子先后进入检测器，检测器得到离子信号，放大器将信号放大并记录在读出装置上。


图2－1 单聚焦质谱仪示意图
    离子电离后经加速器进入磁场中，其动能与加速电压及电荷z有关，即         （2－1）
    其中z为电荷数，e为元电荷（e=1.60×10-19C），U为加速电压，m为离子的质量，v为离子被加速后的运动速度。
具有速度v的带电粒子进入质谱分析器的电磁场中，由于受到磁场的作用，使离子作弧形运动，此时离子所受到的向心力Bzv和运动离心力 相等，得         （2－2）,式中：R为离子弧形运动的曲线半径，B为磁场强度。由式（2－1）和（2－2）可得离子质荷比与运动轨道曲线半径R的关系：
              （2-3）
                （2－4）
式（2－3）和（2－4）称为质谱方程式，它是质谱分析法的基本公式，也是设计质谱仪的主要依据。由式（2－3）可以看出，离子的质荷比m/z与离子在磁场中运动的曲线半径R的平方成正比。若加速电压U和磁场强度B都一定时，不同m/z的离子，由于运动的曲线半径不同，在质量分析器中彼此分开，并记录各自m/z的离子的相对强度。根据质谱峰的位置进行物质的定性和结构分析；根据峰的强度进行定量分析。从本质上讲，质谱不是波谱，而是物质带电粒子的质量谱。
2.2 质谱图
质谱图均用棒图表示，每一条线表示一个峰，代表一种离子。
横坐标为离子质荷比（ ）的数值，
纵坐标为相对强度，即每一个峰和最高峰（称基峰）的比值，
在文献报导中常用质谱表代替质谱图。
2.3各种类型的质谱峰
（1）分子离子峰
分子受电子流轰击，失去一个电子即得到分子离子，出现在谱图上通常是最右边的一个峰，如能正确辨认质谱图上的分子离子峰，就可以直接从谱图上读出被测物的相对分子质量。
判断分子离子峰时要注意氮规则，即不含氮或偶数氮的有机物的相对分子质量为偶数，含奇数氮的有机物的相对分子质量为奇数，分子离子一定是奇电子离子。
（2）同位素峰
有机物中常见， C，H，O，N，S，Cl，Br，I等均有同位素，因此往往在分子离子峰旁边可见一些 M+1，M+2 的小峰，可用来推断分子式。
较常见的是：32S ，34S
           35Cl，37Cl
           79Br，81Br
（3）碎片离子峰
在电子流作用下，分子产生键的断裂，形成质量更小的离子，这些断裂按一定规律进行，对判定结构有重要作用，是学习的重点。
2.4有机物的碎裂反式
（1）表示方法
箭头表示一对电子转移；  ，鱼钩表示一个电子转移
，奇电子阳离子，自由基离子；  ，偶电子离子；  ，自由基，不带电。
（2）裂解类型
简单开裂
如：
α－开裂，常发生在带官能团的化合物上
例：

β－开裂

例：

引起中性小分子脱离的裂解
小分子指H2O，H2S，CH3CO2H，CH3OH，CO，HCN等，脱离小分子的裂解常伴随着重排。
例：

Machafferty 重排
通式：

同，醛，链烯，酰胺，腈，酯，芳香族化合物均可发生
例：


2.5 主要有机物的质谱
（1）烷烃
以正己烷为例，  的 m/e为86，即正己烷的分子质量。还有一系列减去CnH2n+1的峰，如71，57，43，29，其中以 m/e 57为最强峰， m/e 43为次强峰，当异构形式改变时，质谱信号明确不同，见下表
化合物          



最强峰        57        57        43
说明， 难形成，只有在较多的σ－p 超共轭存在下才能稳定生成。
（2）烯烃
烯烃的质谱和烷烃类似，有一系列 峰以及前已述及的β－断裂产物峰，如

（3）醇
醇的分子离子峰较弱，叔醇没有。
首先  
再发生各种碎裂，如
①  ，虚线所示为断裂处，得到烷基离子峰。
②  
③ 大多数的伯醇均有 m/e 18峰，脱去H2O。

（4）醚
醚的质谱峰也较弱
有:
α－裂解         

β－裂解         


（5）醛同
通常M峰显著。
α－断裂          

断裂时先失去大基团。
醛则常有特征峰 m/e 28及M－1峰

（6）羧酸及其衍生物
断裂方式为:         

（7）芳香烃
特征为M峰强。
烷基取代苯最常发生β－断裂，得到基峰91。

亦有α－断裂:         


3、质谱仪器
    质谱仪通常由六部分组成：真空系统、进样系统、离子源、质量分析器、离子检测器和计算机自动控制及数据处理系统。
    现以扇形磁场单聚焦质谱仪为例（图2－1），讨论各主要部件的作用原理。
    （一）高真空系统
    质谱分析中，为了降低背景以及减少离子间或离子与分子间的碰撞，离子源、质量分析器及检测器必须处于高真空状态。离子源的真空度为10-4～10-5Pa，质量分析器应保持10-6Pa，要求真空度十分稳定。一般先用机械泵或分子泵预抽真空，然后用高效扩散泵抽至高真空。
    （二）进样系统
    质谱进样系统多种多样，一般有如下三种方式：
     1．间接进样 一般气体或易挥发液体试样采用此种进样方式。试样进入贮样器，调节温度使试样蒸发，依靠压差使试样蒸气经漏孔扩散进入离子源。
     2．直接进样 高沸点试液、固体试样可采用探针或直接进样器送入离子源，调节温度使试样气化。
     3．色谱进样 色谱－质谱联用仪器中，经色谱分离后的流出组分，通过接口元件直接导入离子源。
     （三）离子源
     离子源的作用是使试样分子或原子离子化，同时具有聚焦和准直的作用，使离子汇聚成具有一定几何形状和能量的离子束。离子源的结构和性能对质谱仪的灵敏度、分辨率影响很大。常用的离子源有电子轰击离子源、化学电离源、高频火花离子源、ICP离子源等。前两者主要用于有机物分析，后两者用于无机物分析。
     目前，最常用的离子源为电子轰击离子源（图3－2）。


图3－2 电子轰击离子源

（四）质量分析器
    质量分析器的作用是将离子源产生的离子按m/z的大小分离聚焦。质量分析器的种类很多，常见的有单聚焦质量分析器、双聚焦质量分析器和四极滤质器等等。
   （1）单聚焦质量分析器 单聚焦质量分析器如图7－1所示。其主要部件为一个一定半径的圆形管道，在其垂直方向上装有扇形磁铁，产生均匀、稳定磁场，从离子源射入的离子束在磁场作用下，由直线运动变成弧形运动。不同m/z的离子，运动曲线半径R不同，被质量分析器分开。由于出射狭缝和离子检测器的位置固定，即离子弧形运动的曲线半径R是固定的，故一般采用连续改变加速电压或磁场强度，使不同m/z的离子依次通过出射狭缝，以半径为R的弧形运动方式到达离子检测器。
    由式（3－3），若固定加速电压U，连续改变磁场强度B，称为磁场扫描，则 ；若固定磁场强度B，连续改变加速电压U，称为电场扫描，则 。无论磁场扫描或电场扫描，凡m/z相同的离子均能汇聚成为离子束，即方向聚焦。由于提高加速电压U仪器的分辨率得到提高，因而宜采用尽可能高的加速电压。当取U为定值时，通过磁场扫描，顺次记录下离子的m/z和相对强度，得到质谱图，单聚焦质量分析器结构简单，操作方便，但分辨率低。
   （2）双聚焦质量分析器 在单聚焦质量分析器中，离子源产生的离子由于在被加速初始能量不同，即速度不同，即使质荷比相同的离子，最后不能全部聚焦在检测器上，致使仪器分辨率不高。为了提高分辨率，通常采用双聚焦质量分析器，即在磁分析器之前加一个静电分析器，如图7－3所示。离子受到静电分析器的作用，改作圆周运动，当离子所受到的电场力与离子运动的离心力相平衡时，离子运动发生偏转的半径R与其质荷比m/z、运动速度v和静电场的电场强度E有下列关系：          （3－5）
由式（3－5）可以看出，当电场强度一定时，R取决于离子的速度或能量。因此，静电分析器是将质量相同而速度不同的离子分离聚焦，即具有速度分离聚焦的作用。然后，经过狭缝进入磁分析器，再进行m/z方向聚焦。这种同时实现速度和方向双聚焦的分析器，称为双聚焦分析器。具有双聚焦质量分析器的质谱仪称为双聚焦质谱仪。


图3－3 双聚焦质量分析器
（3）四极滤质器 四极滤质器是由四根平行的圆柱形金属极杆组成，相对的极杆被对角地连接起来，构成两组电极。如图7－4所示，在两电极间加有数值相等方向相反的直流电压Ude和射频交流电压Urf。四根极杆内所包围的空间便产生双曲线形电场。从离子源入射的加速离子穿过四极杆双曲型电场中，会受到电场作用，只有选定的m/z离子以限定的频率稳定地通过四极滤质器，其它离子则碰到极杆上被吸滤掉，不能通过四极杆滤质器，即达到"滤质"的作用。实际上在一定条件下，被检测离子（m/z）与电压呈线性关系。因此，改变直流和射频交流电压可达到质量扫描的目的，这就是四极滤质器的工作原理。由于四极滤质器结构紧凑，扫描速度快，适用于色谱－质谱联用仪器。


图3－4 四极滤质器

（五）离子检测器和记录系统
     常用的离子检测器是静电式电子倍增器，其工作原理如图3－5所示。电子倍增器一般由一个转换极、10~20个倍增极和一个收集极组成。一定能量的离子轰击阴极导致电子发射，电子在电场的作用下，依次轰击下一级电极而被放大，电子倍增器的放大倍数一般在105～108。电子倍增器中电子通过的时间很短，利用电子倍增器可以实现高灵敏、快速测定。但电子倍增器存在质量歧视效应，且随使用时间增加，增益会逐步减小。
     近代质谱仪中常采用隧道电子倍增器，其工作原理与电子倍增器相似，因为体积小、多个隧道电子倍增器可以串列起来，用于同时检测多个m/z不同的离子，从而**提高分析效率。
     经离子检测器检测后的电流，经放大器放大后，用记录仪快速记录到光敏记录纸上，或者用计算机处理结果。


图3－5 静电式电子倍增器

五、 数据处理和应用
检测器通常为光电倍增器或电子倍增器，所采集的信号经放大并转化为数字信号，计算机进行处理后得到质谱图。质谱离子的多少用丰度表示（abundance）表示，即具有某质荷比离子的数量。由于某个具体离子的“数量”无法测定，故一般用相对丰度表示其强度，即最强的峰叫基峰（base peak），其他离子的丰度用相对于基峰的百分数表示。在质谱仪测定的质量范围内，由离子的质荷比和其相对丰度构成质谱图。在LC/MS和GC/MS中，常用各分析物质的色谱保留时间和由质谱得到其离子的相对强度组成色谱总离子流图。也可确定某固定的质荷比，对整个色谱流出物进行选择离子检测（selected ion monitoring， SIM），得到选择离子流图。质谱仪分离离子的能力称为分辨率，通常定义为高度相同的相邻两峰，当两峰的峰谷高度为峰高的10%时，两峰质量的平均值与它们的质量差的比值。对于低、中、高分辨率的质谱，分别是指其分辨率在100～2000、2000～10000和10000以上。质谱在药物领域的主要应用为药物的定性鉴别、定量分析和结构解析。如果一个中性分子丢失或得到一个电子，则分子离子的质荷比与该分子质量数相同。使用高分辨率质谱可得到离子的精确质量数，然后计算出该化合物的分子式，或者用参照物作峰匹配可以确证分子量和分子式。分子离子的各种化学键发生断裂后形成碎片离子，由此可推断其裂解方式，得到相应的结构信息。质谱用于定量分析，其选择性、精度和准确度较高。化合物通过直接进样或利用气相色谱和液相色谱分离纯化后再导入质谱。质谱定量分析用外标法或内标法，后者精度高于前者。定量分析中的内标可选用类似结构物质或同位素物质。前者成本低，但精度和准确度以使用同位素物质为高。使用同位素物质为内标时，要求在进样、分离和离子化过程中不会丢失同位素物质。在使用FAB质谱和LC/MS（热喷雾和电喷雾）进行定量分析时，一般都需要用稳定的同位素内标。分析物和内标离子的相对丰度采用选择离子监测（只监测分析物和内标的特定离子）的方式测定。选择离子监测相对全范围扫描而言，由于离子流积分时间长而增加了选择性和灵敏度。利用分析物和内标的色谱峰面积或峰高比得出校正曲线，然后计算样品中分析物的色谱峰面积或它的量。解析未知样的质谱图，大致按以下程序进行。
（一）解析分子离子区
(1) 标出各峰的质荷比数，尤其注意高质荷比区的峰。
(2) 识别分子离子峰。首先在高质荷比区假定分子离子峰，判断该假定分子离子峰与相邻碎片离子峰关系是否合理，然后判断其是否符合氮律。若二者均相符，可认为是分子离子峰。
(3) 分析同位素峰簇的相对强度比及峰与峰间的Dm值，判断化合物是否含有C1、Br、S、Si等元素及F、P、I等无同位素的元素。
(4) 推导分子式，计算不饱和度。由高分辨质谱仪测得的精确分子量或由同位素峰簇的相对强度计算分子式。若二者均难以实现时，则由分子离子峰丢失的碎片及主要碎片离子推导，或与其它方法配合。
(5) 由分子离子峰的相对强度了解分子结构的信息。分子离子峰的相对强度由分子的结构所决定，结构稳定性大，相对强度就大。对于分子量约200的化合物，若分子离子峰为基峰或强蜂，谱图中碎片离子较少、表明该化合物是高稳定性分子，可能为芳烃或稠环化合物。
例如：萘分子离子峰m／z 128为基峰，蒽醌分子离子峰m／z 208也是基峰。
分子离子峰弱或不出现，化合物可能为多支链烃类、醇类、酸类等。
（二）、解析碎片离子
(1) 由特征离子峰及丢失的中性碎片了解可能的结构信息。
若质谱图中出现系列CnH2n+1峰，则化合物可能含长链烷基。若出现或部分出现m／z 77，66，65，51，40，39等弱的碎片离子蜂，表明化合物含有苯基。若m／z 91或105为基峰或强峰，表明化合物含有苄基或苯甲酰基。若质谱图中基峰或强峰出现在质荷比的中部，而其它碎片离子峰少，则化合物可能由两部分结构较稳定，其间由容易断裂的弱键相连。
(2) 综合分析以上得到的全部信息，结合分子式及不饱和度，提出化合物的可能结构。
(3) 分析所推导的可能结构的裂解机理，看其是否与质谱图相符，确定其结构，并进一步解释质谱，或与标准谱图比较，或与其它谱(1H NMR、13C NMR、IR)配合，确证结构。


















第四节 有机质谱及相关知识
质谱法在有机化合物结构鉴定中灵敏度高,可以给出化合物的分子量和分子式. 3 W' }) }/
质谱是化合物分子在真空条件下受电子流的"轰击"或强电场等其它方法的作用,电离成离子,同时发生某些化学键的有规律的断裂,生成具有不同质量的带正电荷的离子,这些离子按质荷比,m/z(离子质量m与其所带电荷数z之比)的大小被收集并记录的谱.质谱图记录了它电离后被收集到的各种不同质荷比的离子及其相对丰度(或强度).
4.1质谱计
质谱计主要由高真空系统,进样系统,离子源,加速电场,质量分析器,检测和记录系统组成.
高真空系统:离子源和质量分析器的压力通常分别为(10-4-10-5和10-5-10-6Pa).
进样系统:在真空条件下,固体和沸点较高的液体样品可通过进样推杆将少量样品送入离子源并在其中加热汽化,低沸点样品在贮气器中汽化后进入离子源,气体样品可经贮气器进入离子源.
离子源:样品分子的离子化场所.9 D+ {' B. I* l- B* I+ s1 R8 D7 t
质量分析器:各种离子在质量分析器中按其质荷比(m/z)的大小进行分离并加以聚焦." K9 ^1 b' B! |6 P
检测,记录系统:经过质量分衡器分离后的离子束,按质荷比的大小先后通过出口狭缝,到达收集极,它们的信号经放大后用记录仪记录在感光纸上或送入数据处理系统,由计算机处理以获得各种处理结果.# j$ \% m9 k7 F* Y: K
分辨率(R)是质谱计性能的一个重要指标,高分辨质谱计可测量离子的精确质量. ) }" B1 y6 N) C9 j; C
4.2离子化的方法
离子化的方法很多,用于有机质谱计的主要有电子轰击,化学电离,场致离和场解吸,快原子轰击等.
电子轰击(E1ectron Impact,EI) ( `' U1 E# {- _4 |4 F, z
用约70eV能量的电子束与汽化的样品分子相互作用,使分子(M)中电离电位较低的价电子或非键电子(如O,N的孤对电子)电离,丢失于一个电子生成带正电荷的分子离子(M + e M+. + 2e).进一步裂解生成不同质荷比的带正电荷的碎片离子.某些化合物用EI电离时分子离子峰的强度较弱,甚至不出现,但有较多的碎片离子产生.
4.3质量分析器
在电离室生成的质量为m,电荷为z的正电荷离子经加速电压V的加速,离子的速度为 ,其动能为:m 2/2=zV
离子受到的磁场作用力Bz (沿半径指向圆心)与离子运动的离心力m 2/R大小相等,方向相反 : m 2/R =Bz
m/z = B2R2/2V 8 C/ W/ l& @. `8 T
若V值不变,而磁场强度B由小到大连续改变,则通过收集狭缝被接收的离子的m /z也由小到大地改变,这称之为磁场扫描.通常采用尽可能高的加速电压以提高仪器的分辨率和灵敏度,利用磁场扫描,依次接收并记录下不同m/z的离子的强度,得到质谱图.
质谱图,图中纵坐标为离子的相对强度,横坐标为离子的质荷比. 5 w+ C. " L) e5 d, O1 e) x8 r; b3 L3 p" L! z8 @1 ~0 ~
4.4质谱术语
基峰:质谱图中离子强度最大的峰,规定其相对强度或相对丰度为100.
质荷比:离子的质量与所带电荷数之比,用m/z表示.m为组成离子的各元素同位素的原子核的质子数目和中子数目之和,如H1,C12,13,N14,15,O16,17,18,Cl, 35, 37等
精确质量:低分辨质谱中离子的质量为整数,高分辨质谱给出分子离子或碎片离子的精确质量,其有效数字视质谱计的分辨率而定.分子离子或碎片离子的精确质量的计算基于精确原子量,部分元素的天然同位素的精确质量和丰度见P188:表5.1.
由表中数据计算CO,N2,C2H4的精确分子量依次为27.9949,28.0062,28.0313,所以只要测得它们的精确(百分位)分子量,就可以把这些分子离子区分开来.
2.质谱中的离子 0 ~3 ~9 }. w1 B3 Y( n% s/ k4 k! p
分子离子:由样品分子丢失一个电子而生成的带正电荷的离子,记作M+..
分子离子是质谱中所有离子的起源,它在质谱图中所对应的峰为分子离子峰.
碎片离子:广义的碎片离子为由分子离子裂解产生的所有离子.9 |8 V: H7 T0 Q5 Z
重排离子:经过重排反应产生的离子,其结构并非原分子中所有.在重排反应中,化学键的断裂和生成同时发生,并丢失中性分子或碎片. ( Y* B2 |  Z; ~) _- D6 c6 E) I
母离子与子离子:任何一个离子(分子离子或碎片离子)进一步裂解生成质荷比较小的离子,前者称为后者的母离子(或前体离子),后者称为前者的子离子.
奇电子离子和偶电子离子(分别以OE+.和EE+表示):带有末配对电子的离子为奇电子离子,如M+.,A+.,B+···;无未配对电子的离子为偶电子离子,如D+,C+,E+···;分子离子是奇电子离子.在质谱解析中,奇电子离子较为重要. $ M2 `$ M6 K( t% V6 u/ M
多电荷离子:一个分子丢失一个以上电子所形成的离子称多电荷离子.在质谱图中,双电荷离子出现在单电荷离子的1/2质量处. , O0 L6 s3 N6 f( C
准分子离子:采用CI电离法,常得到比分子量多(或少)1质量单位的离子称准分子离子,如(MH)+,(M - H)+.在醚类化合物的质谱图中出现的M + 1 峰为(MH)+.
亚稳离子:从离子源出口到达检测器之前产生并记录下来的离子称亚稳离子.离子从离子源到达检测器所需时间约10-5秒(随仪器及实验条件而变),寿命大于10-5秒的稳定离子足以到达检测器,而寿命小于10-5秒的离子可能裂解(M1+ M2+ +中性碎片).在质量分析器之前裂解产生的M2+因其动能小于离子源生成的M2+,在磁分析器中的偏转不同,以低强度,于表观质量m*(跨2—3个质量单位)处被记录下来,其m/z一般不为整数.m*与m1,m2(分别为M1,M2离子的质量)之间的关系为:m* = m 22/ m1
在质谱解析中,可利用m*来确定m1与m2之间的"母子"关系.例如:苯乙同的质谱图中出现m/z134,105,77,56.47等离子蜂,56.47为亚稳离子峰.由56.47=772/105可知,m/z77离子是由m/z105离子裂解,丢失CO产生的.
苯乙同的MS谱:  I- S0 b( f3 r  V5 }4 r! h
5.2 分子离子与分子式
5.2.1 分子离子峰的识别) _0 u% {* A: P2 l7 {
分子离子峰必须是最高质荷比的离子峰(同位素离子及准分子离子峰除外);必须是奇电子离子峰;分子离子能合理地丢失中性碎片(自由基或中性分子),与其相邻的质荷比较小的碎片离子关系合理.由M+.合理丢失的中性碎片及化合物的可能结构来源见P190:表5.2.表中数据对识别分子离子峰及推测化合物的类型是有帮助的.
氮律:组成有机化合物的大多数元素,就其天然丰度高的同位素而言,偶数质量的元素具有偶数化合价(如12C为4价,16O为2价,32S为2价,4价或6价,28Si为4价等).奇数质量的元素具有奇数化合价(如1H,35C1,79Br为1价,31P为3价,5价等).只有N反常,质量数是偶数(14),而化合价是奇数(3价,5价).由此得出以下规律,称之氮律. # o  T3 y3 ^6 B$ Q. y1 O
"在有机化合物中,不含氮或含偶数氮的化合物,分子量一定为偶数(分子离子的质荷比为偶数),含奇数氮的化合物分子量一定为奇数.反过来,质荷比为偶数的分子离子峰,不含氮或含偶数个氮".
5.2.2 分子离子峰的相对强度 3 d# |  z' {* u# [- ]+ t: t: p
分子离子峰的相对强度可归纳如下:' X2 {0 c6 b5 b4 v9 R' ]8 g
(1) 芳香族化合物 > 共轭多烯 > 脂环化合物 > 低分子直链烷烃 > 某些含硫化合物.
(2) 直链同,酯,酸,醛,酰胺,卤化物等化合物的分子离子峰通常可见.
(3) 脂肪族醇,胺,亚硝酸酯,硝酸酯,硝基化合物,腈类及多支链化合物容易裂解,分子离子峰通常很弱或不出现.
5.2.3 分子式的推导 3 B) m5 w2 l8 L. l' x* y6 J
1.低分辨质谱法4 p3 @7 O# S+ _: t) N; s+ j
(1) 同位素峰簇及其相对丰度
在质谱图中,分子离子或碎片离子峰往往伴随有较其质荷比大1,2…质量单位的峰,相对于M+.,可记作(M + 1),(M + 2) 峰,这些峰称同位素峰簇.同位素峰簇的相对强度是由同位素原子个数及其天然丰度决定的.表5.3给出常见同位素相对于天然丰度最大的轻同位素(A)的丰度为100时的计算值.6 ?! Y' ]) g, q1 h. p( {
常见元素天然同位素的相对丰度
C H N O F Si P S Cl Br I
A 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 1000 G! _0 m% ]$ n6 A9 B
A+1 1.1 0.016 0.37 0.04 - 5.1 - 0.8 - - -
A+2 - - - 0.2 - 3.4 - 4.4 32.5 98.0 -0 b: K) }0 o! z- B' k9 q' Z* C
由C,H,N,O元素组成的化合物,通用分子式为:CxHyNzOw(x,y,z,w分别为C,H,N,O的原子数目),其同位素峰簇的相对强度可由下式计算:9 J& L& V0 m1 S
RI(M+1)/RI(M) 100 = 1.1x + 0.37z  l/ l0 S9 m+ u6 M$ ~, l
RI(M+2)/RI(M) 100 = (1.1x)2/200 + 0.2w
化合物若含氯或溴,其同位素峰簇的相对丰度按(a+b)n的展开式的系数推算.若二者共存,则按(a + b)m(c + d)n的展开式的系数推算.m,n为分子中氯,溴原子的数目,a,b和c,d在数值上分别为同位素相对丰度比的3,1和1,1.如分子中含有二个氯原子,则同位素峰簇的相对丰度比M M+2) M+4)=9:6: 1相邻两峰之间 m=2 ." s! r0 u* r0 Q: N6 Q! X/ t
(E)-1,2-二氯乙烯的MS图6 ]! @  G: Q. E1 Z3 F8 z  w9 N5 R
(2)利用同位素峰簇的相对丰度推导化合物的分子式
在推导化合物分子式前,要先识别分子离子及其构成的同位峰簇,由数表或谱图读出M+.,M+1,M+2等同位素峰的相对强度,然后利用(5.7),(5.8)式推算C,N,O的数目,结合M+.的质荷比及C,N,O的数目,推算出氢原子的数目.推算的碳原子数目往往是近似值,通常要结合M+.的m/z及其它元素的原子数目而定.M+.的相对强度越小;推算的误差越大.
例1_化合物A的质谱数据及图见P193表5.4,图5.6,推导其分子式.- ~  V: d6 s: p! X! `
设73为M+.,则74为M+1峰,表明分子中含有奇数个氮,利用表5.4中的数据及(5.7)式计算如下:
1.9/31 100 = 1.1x + 0.37z,
设z=1,则x=(6.1 – 0. 37)/1.1 5,若分子式为C5N,其式量大于73,显然不合理.x=4,则y=73 - 12×4 -14=11,可能分子式为C4H11N,UN=0.该式组成合理,符合氮律,可认为是化合物A的分子式.(实际上为二乙胺)" K/ d4 g+ D1 H
例2 化合物B的质谱见P194:图5.7及表5.5,推导其分子式.4 j& N( s6 x' ~, i* _
解:设97为分子离子峰,由于 97与98的相对强度之比约2:1,既不符合C,H,N,O,S化合物的同位素相对丰度比,又不符合图5.5中不同C1,Br原子组成的同位素峰簇的相对丰度.故97可能不是分子离子峰.设98为分子离子峰.# q; m% u- N7 ]7 |0 o
m/z 98(56) M+., 99(7.6) M+1,100 (2.4) M+2,则RI(M+1)/RI(M)×100=13.6,RI(M+2)/RI(M)×100=4.35 |% |( Q$ n" k. F. N
由(M+2)相对强度4.3判断化合物B分子中含有一个硫原子
例3 化合物C的质谱见P195:图5.8及表5.6,推导其分子式/ d" f" V3 i3 B( B) s$ }6 ]3 e/ G

解:164与166,135与137的相对强度之比均近似为1:1故认为164为化合物C的分子离子峰.含有一个溴原子,不含氮或含偶数氮.若能推导出碎片离子85的元素组成,即可知其分子式., f/ [% Y3 Q: r1 P
由m/z:85(49),86(3.2),87(0.11)可知,x = 3.2/49 × 100/1.1 6, 设x =6,则y=13可能的分子式为C6H13Br,因UN=0,是合理的.
设x = 5,w=1,则y=9,可能的分子式为C5H9O, UN=1,也是合理的式子." S: b. v/ w& q, F' H# S
化合物C的可能分子式为C6H13Br或C5H9OBr,
实际上是正溴己烷* _# `& ]4 B* M" J
5.3 有机质谱中的裂解反应
5.3.1研究有机质谱裂解反应的实验方法
有机质谱中的裂解反应是指离子(包括分子离子和碎片离子)进一步裂解生成质荷比较小的碎片离子的反应.研究有机质谱裂解反应常用的方法是亚稳离子法和同位素标记法.- M; B& b, q% C. v( T/ B
亚稳离子法:若m*=m22/m1,则M1是M2的母离子,也就是说M2是由M1裂解产生的.分析这些离子对,对于了解质谱裂解反应过程,离子的结构结构单元可能的连接顺序等都有帮助.
例如:己酸乙酯的质谱图中出现144(M+.),115,99,88(100),71,43等峰,53.7处有一亚稳离子峰.88是由M+.,还是由115裂解产生 由m*可确定.因53.7=882/144,所以88基峰是由分子离子直接丢失56质量单位产生的奇电子离子. 6 g7 C9 S/ N* _- X7 [* `
己酸乙酯的质谱图
5.3.2质谱裂解反应机理   s& d8 ~9 s; U; D/ ]
单电子转移发生的裂解反应称均裂,双电子转移发生的裂解反应称异裂.
(1)自由基位置引发的裂解反应9 X. p+ _$ W6 n
自由基位置引发裂解反应的动力来自自由基有强烈的电子配对倾向,在自由基位置易引发分裂,同时伴随着原化学键的断裂和新化学键的生成. / D) }7 R, q! b% _- z% z
分子离子化时,自由基或电荷位置优先发生在电离电位最低的电子上.有机化合物中,电离电位(I)由小到大的顺序为:非键n电子(O,N,S等杂原子的未成键电子)<共轭 电子<非共轭 电子< 电子.同一主族元素,从上至下,I值依次减小,如Se<S<O.同一周期元素,从左至右,I值增大,如N<O<F. - R4 Z; D* }$ h% Z: [( e
自由基位置引发的裂解反应主要是指含C—Y或C=Y(Y=O,N,S)基团的化合物,与这些基团相连的化学键的均裂在有机质谱中很普遍,如醇,硫醇,硫醚,胺类,醛,同,酯等.裂解通式如下:
(Y = NH,O,S,R'=H,R.这种裂解称 裂解,即正电荷功能团的C —C 键的断裂.)
这种裂解称 裂解
2.自由基位置引发的重排反应
McLafferty重排为 位氢转移,经过六元过渡态;丢失稳定的中性分子的重排,又称 氢重排.通式如下:
5.3.3 有机化合物的一般裂解规律
1.偶电子规律
偶电子离子裂解,一般只能生成偶电子离子(少数化合物例外).换言之,就是质谱中质荷比较小的奇电子离子往往是由质荷比较大的奇电子离子裂解产生的.+ [, u1 m: ^" ~3 _9 _
9 b1 _3 P' Q! }3 V0 i7 @
2.烃类化合物的裂解
烃类化合物的裂解是优先失去大基团,优先生成稳定的正碳离子.正碳离子的稳定顺序是:
C6H5C+H2 CH2=CH-C+H2 C+R3 C+HR2 C+H2R C+H3
正碳离子的稳定程度越高,其离子峰在质谱图中的相对强度越大,如苄基及烯丙基裂解. $ w" x, R# C7 j  |3 c$ U
4 羰基化合物的裂解
羰基化合物的裂解为自由基引发的均裂( 裂解)及正电荷诱导的异裂,OE+.异裂的几率很小,EE+的异裂普遍存在.
5 逆Diels-A1der反应(RDA)
有机化学中Diels-A1der反应是双烯合成,即由一种烯烃加成到另一种共轭烯烃的1,4-位上生成环己烯及其衍生物.质谱学中RDA为环己烯及其衍生物的开环裂解反应. 5 `3 d& R; m; j% P  j( ^, U/ P
5.4 各类有机化合物的质谱 7 f2 V* u6 t  P( }: _: \+ m
1.烷烃
直链烷烃:直链烷烃的分子离子峰可见.出现M-29及一系列CnH2n+1(m/z29,43,57,71…)峰,相邻的对应峰 m=14. m /z43,57相对强度较大;往往是基峰,这是由于可异构化为稳定性高的异丙基离子(CH3C+HCH3)和叔丁基离子((CH3)3C+).随着m/z增大,峰的相对强度依次减弱.
图5.9是正十二烷的质谱,图中m/z43为基峰,m/z57(RI:92),主要裂解如下:
支链烷烃:M+.峰较相应的直链烷烃弱,图谱外貌与直链烷烃有很大不同.支链处优先断裂,正电荷带在多支链的碳上;支链处峰强度增大;烃类化合物质谱中若出现M-15峰,表明化合物可能含有侧链甲基.2-甲基十一烷: ! W; S+ n7 @; O4 `/ V1 {  `
2,2,7,7-四甲基辛烷质谱- A4 M6 N" W* W6 f$ z6 p
2.烯烃 / Y7 @1 |2 I4 O) a% _
烯烃中双键的引入,可增加分子离子螃的强度.直链烯烃质谱图中,出现系列CnH2n-1,CnH2n,CnH2n+1峰群,相邻的对应峰 m=14.形成这种峰群的原因是双键的位置可以迁移,只有当双键上有多取代基或与其它双键共轭时,双键的位置固定.
1-十二碳烯的质谱
3.芳烃8 ^; x% _5 X- Y0 r- Q( _
芳烃类化合物稳定,分子离子峰强., ~& E0 c/ C* V" g& u9 s
烷基取代苯:分子离子峰中等强度或强:易发生苄基裂解,生成的苄基离子往往是基峰;如甲苯m/z 91(M-1)为基峰.正丙苯m/z 91(M-C2H5) 为基峰.
正己基苯的质谱; E8 N4 C- \8 N
5.4.2 醇,酚,醚
1.醇
醇类化合物的分子离子峰弱或不出现. C -C 裂解生成31+14n的含氧碎片离子峰.和环过渡态氢重排,生成M-18-28(失水和乙烯)的奇电子离子峰及系列CnH2n+1,CnH2n-1碎片离子峰.
正戊醇的质谱
2-正戊醇的质谱
2.苯酚
分子离子峰相当强,出现m/z M-28(-CO),m/z M-29 (-CHO)峰. 1 z) O* O0 u+ ?2 U' ~  u
3.醚3 c* _9 b( s( b
脂肪醚:分子离子峰弱.
芳香醚:分子离子峰较强,可见m/z77,65,39等苯的特征碎片离子峰.苯乙醚:
5.4.4 胺类化合物% \% m- K& ^. x
脂肪胺:脂肪胺的分子离子峰很弱.
二**胺
苯胺:苯胺的主要裂解如下 K, W9 X' Y' R/ d3 K
m/z 93 66 65 39
5.4.5卤代烃! a6 |3 h. u+ P
脂肪族卤代烃的分子离子峰弱,芳香族卤代烃的分子离子峰强.分子离子峰的相对强度随F,C1,Br,I的顺序依次增大. 碘苯的质谱:" L; h" x2 Q8 M
5.4.6羰基化合物* E  N/ h9 f& K, g4 l  d" x$ o
含羰基化合物(醛,同,酸,酯,酰胺等)质谱图的共同特征是分子离子峰一般都是可见的,常出现 -氢重排的奇电子离子峰(见表5.8), -裂解时正电荷往往保留在含氧碎片上,碳-碳 键的异裂生成系列CnH2n+1的碎片离子峰.! R7 B# |# A+ N3 m, I8 s* L
主要裂解如下:
5.6 质谱解析及应用 0 G& N$ G) x2 y
(1) 标出各峰的质荷比数,尤其注意高质荷比区的峰.7 Z' [( M- @1 R& r
(2) 识别分子离子峰.
(3) 分析同位素峰簇的相对强度比及峰与峰间的 m值,判断化合物是否含有C1,Br,S等元素.
(4) 推导分子式,计算不饱和度.计算分子式.' P# {& e3 {! h
(5) 由分子离子峰的相对强度了解分子结构的信息. & d% F( g0 s/ C8 J5 D1 f5 ^
(6) 由特征离子峰(见表5.9)及丢失的中性碎片了解可能的结构信息.
(7) 综合分析以上得到的全部信息,结合分子式及不饱和度,提出化合物的可能结构. % N7 |. q8 Q7 C: f% F7 q  K3 n
(8) 分析所推导的可能结构的裂解机理,看其是否与质谱图相符,确定其结构,并进一步解释质谱,或与标准谱图比较,或与其它谱(1H NMR,13C NMR,IR)配合,确证结构. * o1 h0 d8 y3 V, c: d) m8 B: w" K
5.6.2 质谱解析实例 9 M- i4 U( t+ E, v7 r0 @4 Y1 w
例1_化合物E的质谱如下,由谱图推导其结构.(P223)3 E* U9 x* ^8 j' ~" M
解:设高质荷比区m/z 128为M+.峰,与相邻碎片离子峰m/z 100(M-28),m/z 99(M-29)之间关系合理.4 {- x* r& ~" Q. c/ U' R3 l; ~* p
43(100)及m/z 57,71,85,99等系列CnH2n+1或CnH2n+1CO碎片离子峰,
58,86,100的奇电子离子峰,应为 -氢的重排峰,表明化合物含有C=O由于无明显M-1,M-45(COOH),M-OR的离子峰(可排除为醛,酸,酯类化合物的可能性),可认为该化合物为同类化合物.
100为M-28, 86为M-42有以下基团存在:CH3CH2CH2CO-,CH3CH2CH2CH2CO-,或(CH3)2CHCH2CO-
分子式为C8H16O,UN=1,化合物E的可能结构为 1)CH3CH2CH2CO CH2CH2CH2CH3或(2)CH3CH2CH2CO CH2CH(CH3)2主要裂解过程如下: 1 e. _: X& f0 P! ^6 ^
5.6.3 质谱应用实例
1. 质谱在天然产物分析中的应用
2.__ 质谱在立体化学研究中的应用7 q9 ]# g7 }# b0 r
3.__ GC/MS跟踪反应过程2 Z9 n- ?$ @3 K0 u. ?' s: k2 S
4.__GC/MS分析葡萄酒中的有机酸

3、分子量和分子式的确定
3.1 分子量的确定
从理论上讲，除同位素峰外，分子离子峰(Molecular Ion, M+.)呈现在谱图中的最高质量位置。但当分子离子不稳定时，可能导致分子离子峰不在谱图中出现，或生成大于或小于分子离子质量的(M+H)+、(M-H)+ 或(M+Na)+峰等。
M + e → M+. + 2e
对于纯化合物而言，判断分子离子峰时应注意：
（1）峰的强度
分子离子峰的强度依赖于分子离子的稳定性。当分子具有大的共轭体系时，其稳定性高；其次是有双键的化合物的分子离子稳定性较高；环状结构因断裂一个键后仍未改变质量，其分子离子峰也强；支链越多，分子离子越不稳定; 杂原子携带正电荷的能力按周期表自上而下的位置依次增强, 因而硫醇和硫醚的分子离子比醇和醚稳定.
通常有机化合物在质谱中表现的稳定性有以下次序：
芳香环 >脂环> 硫醚、硫同> 共轭烯 > 直链碳氢化合物 > 羰基化合物 > 醚 > 胺 >支链烃 > 晴 > 伯醇 > 仲醇 >叔醇 > 缩醛。
（2）氮规则 (Nitrogen Rule)
对于只含有C、H、O、N的有机化合物，若其分子中不含氮原子或含有偶数个氮原子，则其分子量为偶数；若其分子中含有奇数个氮原子，则其分子量为奇数。
凡是奇电子离子（包括碎片离子）都符合氮规则，而偶电子离子则刚刚相反。
（3）中性碎片（小分子及自由基）的丢失是否合理
如一般由M+.减去4 ~ 14个质量单位或减去21~ 25个质量单位是不可能的。
（4）可采用软电离方法验证
a．降低电子束能量。
b．降低样品加热温度。
c．扩散法。
d．(M+H)+峰的判别。
e．软电离方法：场电离（FI）、场解吸（FD）、化学电离（CI）、解吸化学电离（DCI）、快原子轰击（FAB）、电喷雾电离（ESI）等
软电离方法一般显示明显的准分子离子峰，如 [M+H]+或[M-H]+ 峰、有时会出现[M+Na]+、[M+K]+峰等，而碎片离子峰往往很少，甚至没有。

3.2分子式测定
（1）同位素丰度法[贝农（Beynon）表]
分子式测定可采用同位素丰度法[贝农（Beynon）表]，但此法对分子量大或结构复杂、不稳定的化合物是不适用的。现在一般都采用高分辨质谱法测定，可直接显示可能分子式及可能率。若测出的分子量数据与按推测的分子式计算出的分子量数据相差很小(与仪器精密度有关, 一般小于0.003), 则可认为推测可信的。
表：有机化合物常见元素同位素及其丰度
12C(100%),  13C(1.08%);                   1H(100%), 2H(0.016%);
16O(100%), 17O(0.04%), 18O(0.20%);          14N(100%), 15N(0.37%);
32S(100%), 33S(0.80%), 34S(4.60%);            35Cl(100%), 37Cl(32.5%);
79Br(100%), 81Br(98.0%).

4、电子轰击电离过程
（1）电离：ABC + e- → ABC+ +2e-                    ABC + e- → ABCn+ +（n+1）e-
（2）碎裂：
ABC+ + e- → A+ + BC （AB+ + C或A + BC+ ）   简单断裂
ABC+ + e- → AC+ + B                         重排
（3）分子-离子反应
ABC+ + ABC → ABCABC+      缔合
ABC+ + ABC → ABCA+ + BC   原子或基团剥夺
（4）共振俘获：
ABC + e- → ABC-
（5）离解共振俘获：
ABC + e- → AB- + C
（6）生成离子偶：
        ABC+ + e- → AB+ + C-  + e-
   目前，大多数质谱仪的分析数据取自正离子。

色谱柱如何再生

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qugd 发表于 2017-6-2 10:41
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